Umumnya menggunakan metode pewarnaan supravital. Sampel darah dicampur dengan larutan brilliant cresyl blue (BBC) atau new methylene blue maka ribosome akan terlihat sebagai filament berwarna biru. Jumlah retikulosit dihitung per 1000 eritrosit dan dinyatakan dalam jadi hasilnya dibagi 10. Pewarna yang digunakan memiliki formula sebagai berikut :
1. brilliantCresylBlue (BCB) : brilliantcresylblue 1.0gr; NaCl 0.85% 99.0ml.
saring larutan sebelum dipergunakan(Raja et all,2013).
2. Newmethyleneblue : NaCl 0.8gr; kalium oksalat 1.4gr; new methylene blue N 0.5gr; aquadest 100ml. saring larutan sebelum dipergunakan.
Dianjurkan menggunakan new methylene blue, kesalahan metode ini pada nilai normal 25%. Sampel darah yang digunakan untuk hitung retikulosit adalah darah kapiler atau vena, dengan antikoagulan (EDTA) atau tanpa antikoagulan (segar).
Prosedur
1. Masukkan 0,5 sampai 1 ml larutan pewarna kedalam tabung kecil.
2. Campur 5 tetes darah dengan larutan tadi dan biarkan selama 5 menit. Dari campuran tersebut diambil satu tetes untuk membuat sediaan apus darah tipis, biarkan kering di udara.
3. Periksa dibawah dengan perbesaran 100x. eritrosit Nampak biru muda dan retikulosit akan tampak sebagai sel yang mengandung granula/filament yang berwarna biru. Bila kurang jelas waktu pewarnaannya diperpanjang atau dicounterstain (dicat lagi) dengan cat Giemsa.
4. Kemudian hitung jumlah retikulosit dalam 1000 sel eritrosit. Hitung retikulosit = (jumlah retikulosit per 1000 eritrosit : 10%.
Nilai Rujukan Dewasa : 0.5 – 1.5%, Bayi baru lahir : 2.5 – 6.5%, Bayi : 0.5 – 3.5% dan Anak : 0.5 – 2.0% Faktor-faktor yang mempengaruhi temuan hasil laboratorium :
a. Bila hematokritnya rendah maka perlu ditambahkan darah
b. Cat yang tidak disaring menyebabkan pengendapan cat pada sel-sel eritrosit sehingga terlihat seperti retikulosit
c. Menghitung di daerah yang terlalu padat C. Crossmatch (Reaksi Silang Serasi)
Reaksi silang perlu dilakukan sebelum melakukan transfusi darah untuk melihat apakah darah penderita sesuai dengan darah donor. Mayor Crossmatch adalah serum penerima dicampur dengan sel donor dan Minor Crossmatch adalah serum donor dicampur dengan sel penerima. Jika golongan darah ABO penerima dan donor sama, baik mayor maupun minor test tidak bereaksi. Jika berlainan umpamanya donor golongan darah O dan penerima golongan darah A maka pada test minor akan terjadi aglutinasi. Mayor Crossmatch merupakan tindakan terakhir untuk melindungi keselamatan penerima darah sebaiknya dilakukan demikian sehingga Complete Antibodies maupun incomplete Antibodies dapat ditemukan.
Reaksi silang yang dilakukan hanya pada suhu kamar saja tidak dapat mengesampingkan aglutinin Rh yang hanya bereaksi pada suhu 37°C. Ada beberapa cara untuk menentukan reaksi silang yaitu reaksi silang dalam larutan garam faal dan reaksi silang metode gell (Notoatmodjo, 2012).
1. Reaksi Silang dalam Tabung
Prinsip : Sel donor dicampur dengan serum penerima (Mayor Crossmatch) dan sel penerima dicampur dengan serum donor dalam bovine albumin 20% akan terjadi aglutinasi atau gumpalan dan hemolisis bila golongan darah tidak cocok.
2. Tujuan
Untuk menentukan cocok tidaknya darah donor dengan darah penerima untuk persiapan transfusi darah.
Alat, reagensia dan bahan pemeriksaan : Tabung reaksi, pipet tetes, sentrifuge, tabung sentrifuge, bovine albumin 20%, mikroskop, NaCl 0,9%, serum Coombs, serum eryhtrosit 5 %. Teknik kerja :
a. Pembuatan suspense Eryhtrosit 5 %
1. Kedalam tabung diisi dengan larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml.
2. Tambahkan 5 tetes darah EDTA dan campur.
3. Putar pada sentrifuge pada 1500 rpm selama 5 menit
4. Cairan dibuang dan pada endapan ditambahkan larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml. campur dan putar lagi, ulangi langkah tadi sebanyak 3 kali.
5. Terakhir pada penambahan NaCl 0,9 % yang ke-4 kalinya sebanyak 5 ml merupakan suspensi eryhtrosit 5 %.
b. Pemeriksaan reaksi silang fase I
1. Dua buah tabung reaksi kecil dalam rak, yang sebelah kiri untuk mayor test dan sebelah kanan untuk minor test.
2. Tabung kiri diisi dengan 2 tetes serum penerima dan 2 tetes suspense erythrosit donor 5 % dalam larutan NaCl 0,9 % dan 2 tetes bovine albumin 20%.
3. Tabung kanan diisi dengan 2 tetes serum donor dan 2 tetes suspense erythrosit penerima 5 % dalam larutan NaCl 0,9 % 2 tetes bovine albumin 20%.
4. Masing-masing tabung dicampur dan diputar disentrifuge pada 1000 rpm selama 1 menit.
5. Goyang dengan hati-hati dan periksa adanya aglutinasi dan hemolisis.
6. Bila hasil Mayor dan minor negatif, dilanjutkan ke fase II
7. Bila hasil Mayor dan minor positif, pemeriksaan tidak dilanjutkan (tidak cocok)
c. Crossmatch Fase II
1. Tabung tadi diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit 2. Putar selama 1 menit pada 1000 rpm disentrifuge.
3. Baca adanya aglutinasi dan hemolisis dengan menggoyang perlahanlahan sama dengan fase I, bila negatif dilanjutkan ke fase III.
d. Crossmatch Fase III
1. Sel darah merah dicuci dengan NaCl 0,9% 3-4 kali
2. Tambahkan 2 tetes serum Coombs pada kedua tabung mayor dan Minor test.
3. Putar pada sentrifuge 1000 rpm selama 1 menit.
4. Baca adanya aglutinasi dan hemolisis dengan menggoyang perlahanlahan sama dengan fase I secara makroskopis.
Penafsiran :
1. Bila aglutinasi dan hemolisis negatif (-) maka darah dapat ditransfusikan.
2. Bila aglutinasi dan hemolisis positif (+) maka darah tidak dapat ditransfusikan (tidak cocok).
3. Pemeriksaan Crossmatch
Metode Gell Prinsip : Anti body yang terdapat dalam serum, plasma bila direaksikan dengan antigen pada sel darah merah, melalui inkubasi pada suhu 37°C dan dalam waktu tertentu dengan penambahan anti imunoglobin terjadi reaksi aglutinasi.
Alat dan bahan : Tabung reaksi, mikropipet 50 ml, 25 ml, centrifuge, incubator, kartu cross match (card liss/coombs card), serum donor, serum pasien, sel donor, sel pasien, reagen Diluent 2 Prosedur :
1. Buat suspense sel pasien dan donor 0,8 – 1 % cara : ambil ditabung 500 ml Dluent 2 dengan dispenser.
2. Ambil 5 ml sel darah merah atau darah lengkap → masukkan ke tabung yang ada Diluent 2-nya
3. Campur dalam homogenkan
4. Ambil liss/Coombs card, tandai dengan identitas pasien/donor, buka penutup aluminium.
a. Mayor : 50 ul suspensi sel donor ± 25 ul serum pasien b. Minor : 50 ul suspensi sel pasien ± 25 ul serum donor c. Auto control : 50 ul suspensi sel pasien ± 25 ul serum pasien
5. Masukkan coombs card ke incubator. Inkubasi 37°C, 15 menit (tekan tombol timer 1/2/3) 6. Pindahkan coombs card ke centrifuge. Tekan tombol start (centrifuge selama 10 menit). Baca reaksi. Keterangan : a. Hasil positif pada crossmatch mayor.
1. Periksa sekali lagi golongan darah pasien apakah sudah sama dengan donor.
2. Artinya ada regular antibodi pada serum pasien.
3. Harus dilakukan screering dan identifikasi antibod pada serum pasien, dalam hal ini sampel darah dikirim ke UDD pembina.
b. Hasil positif pada crossmatch minor, autocontrol = negative. Artinya ada irregular antibodi pada serum donor. Solusi : ganti dengan darah donor yang lain
c. Hasil positif pada crossmatch minor, autocontrol = positif. Artinya ada autobodi pada serum pasien. Bandingkan positif pada minor dan autocontrol
Serum antiglobulin meningkatkan sensitivitas pengujian in vitro. Antibodi kelas IgM yang kuat biasanya menggumpalkan eritrosit yang mengandung antigen yang relevan secara nyata, tetapi antibodi yang lemah sulit dideteksi.
Banyak antibodi kelas IgG yang tak mampu menggumpalkan eritrosit walaupun antibodi itu kuat. Semua pengujian antibodi termasuk uji silang tahap pertama menggunakan cara sentrifugasi serum dengan eritrosit. Sel dan serum kemudian diinkubasi selama 15-30 menit untuk member kesempatan antibody melekat pada permukaan sel, alalu ditambahkan serum antiglobulin dan bila penderita mengandung antibodi dengan eritrosit donor maka terjadi gumpalan.
Uji saring terhadap antibod penting bukan hanya pada transfusi tetapi juga ibu hamil yang kemungkinan terkena penyakit hemolitik pada bayi baru lahir.
Pemeriksaan Crossmatch di UTD dan BDRS saat ini menggunakan metode gel dalam cup kecil yang lebih mudah dan praktis, metode ini telah menggantikan metode tabung yang lebih sulit dan memerlukan banyak peralatan untuk pemeriksaan. Namun begitu metode tabung yang saat ini telah menggunakan teknik yang lebih ketat yaitu menggunakan beberapa fase pemeriksaan dan medium pemeriksaan yang lebih banyak, missal menggunakan bovine albumin, serum coombs dan inkubasi pada suhu 37°C yang akan menambah sensitivitas pemeriksaan(Cipta Nurgaha, 2015).
PEMERIKSAAN DARAH