Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Perlakuan iradiasi sinar gamma dilakukan di Laboratorium Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Iradiasi (PATIR), Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Pasar Jumat, Jakarta Selatan. Pengamatan stomata dilakukan di Laboratorium Mikro Teknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari hingga November 2010.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksplan steril dari dua varietas krisan, yaitu Dewi Ratih dan Puspita Nusantara yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Hias (BALITHI). Media dibedakan menjadi dua, yaitu media perbanyakan dan media perlakuan. Komposisi media yang digunakan untuk perbanyakan adalah MS0, sedangkan komposisi media setelah perlakuan adalah MS dengan tambahan ZPT berupa 1 ppm BAP, agar sebagai bahan pemadat media dan sukrosa sebagai sumber karbohidrat. Bahan lain yang digunakan adalah alkohol 70%, aquades, spirtus, chlorox, karet, wrap, dan tisu. Bahan untuk pengamatan stomata adalah selotip dan preparat.
Alat yang digunakan terdiri atas peralatan gelas, alat untuk sterilisasi, dan alat-alat lain. Peralatan gelas meliputi botol kultur, botol ukur, gelas piala, erlenmeyer, labu takar, cawan petri, dan gelas ukur. Alat untuk sterilisasi yaitu autoklaf, Laminar air flow cabinet, lampu bunsen, pinset, gunting, dan scalpel. Alat-alat lainnya adalah pH meter, timbangan analitik, plastik transparan, karet gelang, sprayer, rak kultur, serta alat pendukung untuk pengamatan. Iradiasi sinar gamma dilakukan di dalam radiator Gamma Chamber 4000A (Gambar 4A)). Alat untuk pengamatan stomata adalah mikroskop cahaya (Gambar (4B)) dan silet.
Gambar 4. Alat yang Digunakan dalam Penelitian; (A) Gamma Chamber
4000A dan (B) Mikroskop Cahaya
Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan perlakuan faktorial dengan dua faktor yang disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Faktor pertama adalah varietas krisan, yaitu Puspita Nusantara dan Dewi Ratih. Faktor kedua adalah dosis iradiasi yang terdiri atas lima taraf, yaitu 0 (kontrol), 20, 40, 60, dan 80 Gy. Terdapat 10 kombinasi perlakuan dan setiap kombinasi terdiri atas 10 ulangan sehingga terdapat 100 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri atas dua planlet sehingga terdapat 200 planlet.
Model linear aditif rancangan percobaan yang digunakan: Yij = μ + αi+ βj+ (αβ) i j + εi j
i = 1, 2
j = 1, 2, 3, 4, 5
k = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
Yij = Nilai pengamatan pengaruh faktor varietas ke-i, faktor dosis iradiasi ke- j, dan ulangan ke-k
µ = Rataan umum hasil pengamatan untuk setiap satuan percobaan αi = Pengaruh faktor varietas ke-i
βj = Pengaruh faktor dosis iradiasi ke-j
(αβ) i j = Pengaruh interaksi faktor varietas ke-i dengan faktor dosis iradiasi ke-j ijk = Galat percobaan
Data yang diperoleh diuji secara statistik dengan uji F. Jika berbeda nyata, maka akan dilakukan uji lanjut dengan DMRT pada dosis 5%. Keragamaan fenotipik (σ2f) dihitung melalui perbandingan antara ragam fenotipik (σ2f) dengan standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) dari variabel yang diamati. Nilai ragam fenotipik dihitung berdasarkan Steel and Torie (1995) sebagai berikut:
σ2
f = –
Keterangan: σ2f = ragam fenotipik
Xi = nilai rata-rata genotipe ke-1
n = jumlah genotipe yang di uji
Standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Sd σ2
f = σ
Kriteria terhadap keragaman dihitung sebagai berikut: σ2
f ≥ 2* Sd (σ2f) luas σ2
f < 2* Sd (σ2f) sempit
Pelaksanaan Penelitian
Pelaksaan penelitian terdiri atas lima tahap, yaitu tahap persiapan, perbanyakan planlet, perlakuan iradiasi sinar gamma, penanaman eksplan setelah iradiasi, dan pengamatan stomata serta kloroplas (Gambar 5).
1. Tahap Persiapan
a) Sterilisasi Alat dan Media
Sterilisasi bertujuan untuk membersihkan alat dan media yang akan digunakan dalam penelitian. Peralatan tanam dan botol kultur yang telah dicuci bersih dimasukkan ke dalam autoklaf dengan tekanan 17.5 psi (pound per square inch) dan suhu 121oC. Sterilisasi peralatan dilakukan selama 30 menit, sedangkan sterilisasi media dilakukan selama 15 menit.
Laminar air flow cabinet dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringkan dengan tisu untuk menjaga agar laminar tetap steril. Alat dan bahan-
bahan yang akan digunakan juga disemprotkan dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam laminar.
b) Pembuatan Media Perbanyakan dan Media Perlakuan
Media perbanyakan yang digunakan adalah media MS0 dengan komposisi sesuai standar (Lampiran 1). Tahap awal adalah pembuatan larutan stok yang terdiri atas laruran stok A, B, C, D, E, F, Vitamin, dan Myo-Inositol untuk volume larutan 1 liter. Sukrosa ditambahkan sebagai sumber energi dan agar sebagai bahan pemadat media. pH media diatur hingga mencapai 5,8 dengan menambahkan HCI atau NaOH.
Media kultur yang digunakan setelah perlakuan iradiasi adalah MS padat yang ditambahkan 1 ppm BAP. pH media diatur hingga mencapai 6. Media dimasukkan ke dalam botol kultur lalu ditutup dengan plastik bening dan diberi label sesuai perlakuan. Botol kultur yang telah berisi media disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 17.5 psi dan suhu 121oC selama 20 menit, kemudian disimpan di ruang kultur.
2. Perbanyakan Eksplan
Perbanyakan eksplan dengan tunas dilakukan selama delapan minggu menggunakan media MS0. Setiap satu botol kultur terdiri atas lima eksplan krisan. Perbanyakan dilakukan di dalam laminar air flow cabinet yang telah disterilisasi dengan alkohol 70% dan disinari dengan UV selama satu jam. Alat yang digunakan disterilisasi dengan alkohol 70% terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam laminar.
Setelah eksplan krisan mencukupi 200 eksplan, lalu dilakukan persiapan untuk perlakuan iradiasi sinar gamma, yaitu penyeragaman tinggi dan jumlah daun pada media MS0. Eksplan yang digunakan adalah tunas pucuk dari eksplan krisan dengan panjang 0.5 cm dengan 2-3 daun. Setiap satu botol kultur hanya terdiri dari dua eksplan krisan.
Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur, lalu ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang. Setelah itu, botol kultur dipindahkan ke ruang kultur (suhu 16oC) selama 1 minggu.
3. Perlakuan Iradiasi Sinar Gamma
Eksplan krisan yang telah berumur 1 MST (minggu setelah tanam) dengan tinggi 1 cm diberi perlakuan iradiasi. Iradiasi dilakukan di Laboratorium Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Iradiasi (PATIR) dengan menggunakan alat
Gamma Chamber 4000A pada dosis 20, 40, 60 dan 80 Gy, kecuali eksplan yang akan dijadikan kontrol (0 Gy).
4. Penanaman Eksplan Setelah Iradiasi
Tunas pucuk krisan yang telah diiradiasi sesuai dosis perlakuan segera disubkultur pada media perlakuan berupa MS dengan tambahan 1 ppm BAP, pada hari yang sama. Hal ini disebabkan karena media yang terkena iradiasi bersifat toksik bagi tanaman. Setiap satu botol kultur hanya terdiri dari dua eksplan krisan agar tidak terjadi persaingan nutrisi antar eksplan dan memudahkan dalam pengamatan.
Subkultur dilakukan setelah 10 MSI (minggu setelah iradiasi) dengan cara memindahkan eksplan ke media baru dengan komposisi yang sama dengan media perlakuan. Hal ini bertujuan untuk mencukupi hara yang dibutuhkan oleh tanaman karena nutrisi yang ada pada media sebelumnya telah diserap tanaman.
5. Pengujian Stomata dan Kloroplas
Pengamatan stomata dilakukan saat 14 MSI (minggu setelah iradiasi) di Laboratorium Mikro Teknik. Pengamatan stomata dilakukan dengan menggunakan 10 daun sebagai ulangan untuk masing-masing perlakuan iradiasi, kecuali perlakuan di atas 20 Gy. Stomata yang diamati adalah stomata yang berada di permukaan bawah daun. Setiap ulangan berasal dari planlet yang berbeda. Daun yang digunakan untuk pengamatan stomata adalah daun tua yang berada di bagian bawah dari planlet. Stomata dan kloroplas diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 400 kali dengan luas bidang pandang 0.28 mm2. Alur kegiatan penelitian disajikan pada Gambar 5.
Pengamatan
Pengamatan dilakukan pada 0-12 MSI terhadap dua peubah, yaitu:
1. Kuantitatif, pengamatan dilakukan setiap satu minggu sekali dari 0-12 MSI. Variabel yang diamati antara lain :
• Persentase kontaminasi
Pengamatan dilakukan pada 1 MSI terhadap tanaman dan media yang terkontaminasi oleh cendawan atau bakteri.
• Waktu munculnya tunas, akar, dan kalus pertama
Pengamatan dilakukan pada 1 hari setelah iradiasi (HST) untuk mengetahui waktu terbentuknya tunas, akar, dan kalus pertama kali.
• Tinggi tunas
Tinggi tunas diukur dari permukaan media sampai titik tumbuh tanpa mengeluarkan planlet dari botol kultur.
• Jumlah dan persentase eksplan bertunas
Pengamatan dilakukan untuk melihat jumlah dan persentase eksplan yang membentuk tunas.
• Jumlah dan persentase eksplan berkalus
Pengamatan dilakukan untuk melihat jumlah dan persentase eksplan yang membentuk kalus.
• Jumlah dan persentase eksplan berakar
Pengamatan dilakukan untuk melihat jumlah dan persentase eksplan yang membentuk akar.
• Jumlah tunas
Pengamatan dilakukan terhadap jumlah tunas yang dibentuk oleh setiap eksplan.
• Jumlah daun
Pengamatan dilakukan terhadap jumlah daun yang telah membuka sempurna yang dibentuk oleh setiap eksplan.
• Jumlah akar
Pengamatan dilakukan terhadap jumlah akar yang dibentuk oleh setiap eksplan.
• Jumlah stomata dan kloroplas
Jumlah stomata dan kloroplas diamati dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400 kali dengan luas bidang pandang 0.28 mm2. Stomata yang diamati berasal dari permukaan bawah daun. Kloroplas yang diamati merupakan jumlah kloroplas di dalam dua sel penjaga.
2. Kualitatif, pengamatan dilakukan setiap dua minggu sekali sejak 1-12 MSI saat eksplan di dalam botol. Variabel yang diamati antara lain :
• Perubahan warna, ukuran, dan bentuk daun
Pengamatan dilakukan secara visual terhadap warna dan ukuran daun tanpa mengeluarkan tanaman dari botol kultur. Pengamatan terhadap perubahan bentuk daun, yaitu bergerigi, bergelombang atau perubahan lain.
• Perubahan warna batang
Gambar 5. Alur Kegiatan Penelitian
Perbanyakan planlet
Persiapan alat Persiapan media dan
bahan tanam Perbanyakan tunas di media dasar (MS0) Subkultur eksplan setelah iradiasi ke media perlakuan Pengamatan:
- Jumlah dan persentase kontaminasi - Waktu munculnya akar, tunas, dan
kalus pertama - Tinggi planlet
- Jumlah dan persentase eksplan berkalus, berakar, dan bertunas - Perubahan warna dan ukuran daun - Perubahan warna batang
- Perubahan warna kalus - Jumlah stomata dan kloroplas
Perlakuan iradiasi sinar gamma pada tunas in vitro Stok planlet krisan varietas Dewi Ratih
dan varietas Puspita Nusantara