Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan mengambil contoh darah anjing yang dilalulintaskan dari Pulau Jawa ke Sumatera melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak-Banten yang merupakan wilayah kerja Balai Karantina Pertanian Kelas II Cilegon. Serum contoh akan diperiksa menggunakan teknik uji ELISA Rabies di Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP) Jakarta. Penelitian dilakukan selama bulan Januari hingga Juli 2008.
Materi Penelitian
Sebanyak 1-2 ml serum darah anjing diambil dari vena femoralis atau vena saphena menggunakan syringe sucihama berukuran tiga mililiter. Syringe yang telah berisi darah dibiarkan pada suhu ruang yaitu pada suhu 25-27° C sampai terjadi pemisahan antara serum dan bekuan sel darah. Cairan serum dipindahkan ke tabung gelas/tabung plastik sucihama. Tabung berisi serum disimpan di dalam kotak yang berisi es batu dengan suhu -4 °C atau langsung dimasukkan ke dalam lemari pendingin bersuhu –20 ˚C sampai serum tersebut akan diperiksa. Cairan serum diinaktivasi terlebih dahulu sebelum pemeriksaan dengan cara menempatkannya pada penangas air (waterbath) bersuhu 56 ˚C selama 30 menit.
Metode Penelitian
Contoh serum darah anjing diperiksa menggunakan kit ELISA SERELISATM Rabies Ab Mono Indirect/ASRAB3 (Synbiotics Europe) dengan kepekaan sebesar 76,2 % dan spesifisitas 97,2 %. Prinsip kerja dari ELISA adalah berdasarkan atas ikatan antigen (Ag) yang melapisi bagian dasar sumur cawan mikro (microplate) dengan antibodi (Ab) dari serum dan konjugat yang ditandai dengan adanya perubahan warna karena adanya penambahan substrat.
Titer serum ditentukan berdasarkan optical density (OD) dalam bentuk equivalen unit terhadap serum baku OIE. Hasil titer protektif harus menunjukkan nilai ≥ 0,6 EU/ml yang nilainya equivalen dengan ≥ 0,5 IU/ml sebagai baku
protektif titer antibodi menurut OIE. Sedangkan nilai kurang dari nilai baku akan dianggap tidak protektif.
Alat dan Bahan
Biosafety cabinet kelas II, ELISA reader, ELISA washer, mikroplat dasar V, mikropipet multi 20 -200 µI, mikropipet tunggal 5-50 µI, mikroplat dasar V (kit berjumlah 6 @ 16 sumur), Konjugat 2,5ml (tutup oranye) yang berisi Protein A/Peroksidase dengan kadar 10x, Konjugat pengencer 50 ml (Ready to Use), Buffer Peroksidase Substrat 50 ml (Ready to Use), Kontrol Negatif 2,5 ml (tutup hijau) dengan kadar 10x, Kontrol Positif 2,5ml (tutup merah) dengan kadar 10x, Sample Diluent/SD 50 ml (Ready to Use), Wash Solution 200ml dengan kadar 10x, Stop Solution 25 ml (Ready to Use), 6 Adhesive film.
Cara Kerja
Kit ELISA, contoh dan serum baku OIE disiapkan pada suhu 27 oC (suhu ruang) selama satu jam. Pengenceran dilakukan dengan larutan pencuci (wash solution) satu bagian (20 ml) + sembilan bagian (180 ml) air suling. Satu cawan dasar V disiapkan untuk pengenceran dan diisi 90 µI SD pada AI-GI untuk serum baku OIE dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah contoh yang akan diuji. Pengisian contoh dilakukan tanpa penggandaan/tidak duplo.
Sebelumnya tablet serum OIE dilarutkan dalam air suling 0,5 ml (batas garis pada vial) dan kemudian dilakukan pengenceran serum baku OIE seperti yang terpapar pada Tabel 5 di bawah ini.
Sebanyak 10 µl serum contoh dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang sudah terisi SD dan dicampur mulai dari sumur H1, A2, B2, C2, dan seterusnya sesuai dengan jumlah contoh. Plate Kit ELISA disiapkan sesuai dengan jumlah serum contoh. Sebanyak 90 µl SD dimasukkan ke dalam sumur A1 dan A2 untuk kontrol negatif dan sumur B1 dan B2 untuk kontrol positif. Kemudian sebanyak 90 µl SD dimasukkan ke dalam sumur C1, D1, E1, F1, G1, H1, dan C2, D2, E2, F2, G2, H2, dan A3, A4 untuk serum baku OIE dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah serum contoh yang akan diuji (DUPLO).
Tabel 5 Pengenceran serum baku OIE Kadar Jumlah 1 : 10 10 µl OIE + 90µl SD 1 : 30 10 µl OIE + 290µl SD 1 : 100 10 µl 1/10 + 90µl SD 1 : 150 10 µl 1/30 + 80µl SD 1 : 300 10 µl 1/30 + 90µl SD 1 : 1000 10 µl 1/100 + 90µl SD 1 : 3000 10 µl 1/300 + 90µl SD Ket. SD : Sample Diluent
OIE : Serum baku OIE
Sebanyak x10 µl kontrol negatif dimasukkan ke dalam sumur A1 dan A2; sebanyak 10 µl kontrol positif ke dalam sumur B1 dan B2; sebanyak 10 µl serum baku OIE yang telah diencerkan ke dalam sumur C1, D1, E1, F1, G1, H1 dan C2, D2, E2, F2, G2, H2 dan A3, A4 dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah serum contoh yang akan diuji dan lakukan secara duplo.
Pengenceran akhir akan diperoleh seperti yang terpapar dalam Tabel 6 di bawah ini.
Tabel 6 Pengenceran akhir serum baku OIE
1 2 3 4 A N 1 : 10 N 1 : 10 OIE 1 : 30000 OIE 1 : 30000 B P 1 : 10 P 1 : 10 S1 1 : 100 S1 1 : 100 C OIE 1 : 100 OIE 1 : 100 S2 1 : 100 S2 1 : 100 D OIE 1 : 300 OIE 1 : 300 S3 1 : 100 S3 1 : 100 E OIE 1 : 1000 OIE 1 : 1000 S4 1 : 100 S4 1 : 100 F OIE 1 : 1500 OIE 1 : 1500 S5 1 : 100 S5 1 : 100 G OIE 1 : 3000 OIE 1 : 3000 S6 1 : 100 S6 1 : 100 H OIE 1 : 10000 OIE 1 : 10000 S7 1 : 100 S7 1 : 100
Mikroplat ditutup dengan adhesive film dan lalu diletakkan di atas pengocok. Mikroplat kemudian diinkubasi pada suhu 37± 3 oC selama 1 jam ± 5 menit. Setelah masa inkubasi tercapai, cairan dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali masing-masing selama tiga menit. Pengenceran konjugat dilakukan dengan perbandingan 1 : 9, yaitu 250 µl konjugat + 2250 µl pelarut. Sebanyak 100 µl konjugat ditambahkan ke dalam semua sumur dan diinkubasi pada suhu 37 ± 3 oC selama 1 jam ± 5 menit. Setelah masa inkubasi tercapai, cairan dibuang dan cuci empat kali masing-masing tiga menit. Sebanyak 100 µl substrat buffer peroksidase ditambahkan ke dalam semua sumur. Mikroplat tidak ditutup
adhesive film dan diletakkan di atas pengocok. Mikroplat diinkubasi pada suhu 20 ± 5 oC selama 30 menit ± 5 menit sehingga warna larutan akan berubah menjadi biru. Sebanyak 50 µl stop solution ditambahkan sehingga warna berubah menjadi kuning, diletakkan di atas pengocok dan terakhir diletakkan pada mesin ELISA reader untuk membaca hasil dengan OD pada 450 nm/630 nm.
Nilai valid jika OD positif kontrol ≥ 0,300, OD negatif kontrol < 0,50 x OD positif kontrol, koefisien korelasi diantara Ln ODs dan Ln Rabies Ab untuk serum baku OIE > 0,95. Titer kalkulasi dilakukan dengan menggunakan:
Ln [Rab Ab Concentration (EU/ml)] = a+b * Ln OD
Contoh Rab Ab Concentration ( EU/ml ) = e (a=b * Ln OD )
Jika titer kalkulasi > 0,6 artinya hewan protektif < 0,6 artinya hewan tidak protektif
Rancangan Penelitian Penentuan contoh
Jumlah contoh serum darah yang akan diperoleh ditentukan berdasarkan rumus Leech dan Seller (1979) :
n = 4 pq L²
Untuk:
n = besaran contoh, p = asumsi prevalensi, q = 1-p, dan L² = galat yang diinginkan.
Asumsi yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu populasi contoh merupakan satu kedatangan rombongan anjing yang akan dibawa ke Pulau Sumatera. Penentuan contoh di alat angkut dilakukan secara acak.
Analisis Data
Nilai hasil yang didapat dimasukkan ke dalam program dari kit ELISA SERELISA Rabies Ab Mono Indirect/Asrab3® (Synbiotic Europe) yang ada dan akan dihasilkan titer antibodi rabies dari contoh serum darah tersebut. Bila titer antibodi rabies lebih dari 0,6 EU/ml maka hewan yang diuji protektif terhadap
rabies dan bila nilainya kurang dari 0,6 EU/ml berarti hewan tersebut tidak protektif terhadap rabies.
Data-data penunjang tentang berbagai faktor yang dapat menjadi faktor resiko infeksi seperti umur, ras, riwayat vaksinasi dan asal daerah diperoleh dari Surat Keterangan Kesehatan Hewan (SKKH). Data-data ini digunakan untuk menentukan hubungan kejadian penyakit dengan parameter yang dilihat.
Dalam penelitian ini digunakan tiga variabel untuk mengetahui faktor yang berpengaruh terhadap efektivitas vaksinasi dengan hasil uji ELISA rabies yang protektif yaitu (1) daerah asal anjing, (2) jarak vaksinasi dengan pengambilan serum contoh darah anjing dan (3) umur anjing saat dilakukan pengambilan contoh.
