BAHAN DAN METODE

Kerangka pemikiran penelitian ini dijabarkan dalam tahapan kegiatan penelitian seperti pada diagram berikut (Gambar 1).

Gambar 1 Kerangka pemikiran metode penelitian. Uji In-vivo pada Domba

• Konsumsi bahan kering

• Kecernaan pakan

• Pertambahan bobot badan harian

• Konversi pakan

• Karakteristik rumen (pH, NH3, VFA)

• Populasi Mikroba Rumen •Income over feed cost (IOFC)

Pembuatan Probiotik Pembuatan

Suplemen Katalitik Probiotik I

(Probion)

Probiotik II

Mikroba Rumen Kerbau (MRK)

•Analisis Populasi mikroba rumen (total bakteri, bakteri selulolitik, fungi selulolitik)

Pencampuran Probiotik dengan Suplemen Katalitik

Kombinasi I :

(Probion + Suplemen katalitik)

Kombinasi II :

(Probiotik MRK + Suplemen katalitik)

Pembuatan Konsentrat

16 Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium dan kandang percobaan Balai Penelitian Ternak Bogor dan sebagian di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Peternakan IPB. Waktu pelaksanaan dimulai bulan Februari 2008 sampai dengan Mei 2008.

Tahapan Pelaksanaan Penelitian

Pembuatan Probiotik

Ada dua jenis probiotik yang digunakan dalam penelitian ini, yakni probiotik probion yang mengandung 17 x10⁹ sel/gram bakteri dan sudah merupakan produk komersil dari Balai Penelitian Ternak Ciawi yang dibuat menurut prosedur Haryanto et al. (1998), sedangkan satu lagi adalah probiotik yang dibuat sendiri berasal dari mikroba rumen kerbau (MRK). Probiotik jenis kedua ini dibuat melalui serangkaian pengkajian yang mengutamakan tercapainya karakteristik populasi mikroba rumen yang optimal, baik dilihat dari total bakteri, jumlah bakteri selulolitik maupun jumlah fungi selulolitik.

Terdapat dua perlakuan utama pada pembuatan probiotik ini yakni perlakuan enrichment dan perlakuan langsung (tanpa enrichment), yang diulang ke dalam dua proses yaitu aerob dan anaerob untuk masing-masing perlakuan, sehingga diperoleh perlakuan dan proses ulangan mana yang menunjukkan karakteristik populasi rumen terbaik. Tahapan pembuatan dan pengujian probiotik berbasis cairan rumen kerbau ini, sebagian besar mengikuti Widyastuti (2005) dan Lee et al. (2000). Dijelaskan lebih rinci dalam rangkaian kegiatan berikut ini.

a. Persiapan Bahan

Rumput raja ditimbang bobot segarnya, kemudian dipotong dengan ukuran 3-5 cm dan dijemur dibawah sinar matahari sekitar dua hari. Setelah kering, bahan tersebut (rumput raja) dimasukkan ke dalam oven 60 ⁰C selama ± 24 jam dan ditimbang bobotnya. Selanjutnya bahan dimasukkan ke dalam eksikator dan didinginkan 2-3 jam, kemudian ditimbang bobot kering akhir dan terakhir digiling.

Bahan-bahan lain yang digunakan adalah larutan Mc.Dougall, media pengenceran, media agar dan media define dengan prosedur pembuatan dapat dilihat pada Lampiran 1. Cairan rumen kerbau yang digunakan adalah jenis

17 kerbau lumpur yang diperoleh dari Rumah Potong Hewan milik rakyat yang ada di daerah sekitar Kecamatan Ciampea dan Leuwiliang.

b. Tahap Pengkayaan

Terdapat dua perlakuan utama dalam pengkajian cairan rumen kerbau sebagai probiotik yakni perlakuan langsung (tanpa diperkaya) dan perlakuan pengayaan (enrichment). Kegiatan pengayaan ini dimulai dengan mempersiapkan botol serum yang diisi bahan pakan sumber serat (rumput raja) sebanyak 0.5 gram dan larutan McDougall 40 ml setiap botolnya. Untuk perlakuan anaerob, maka ke dalam botol tersebut dialiri gas CO2 dan ditutup dengan karet serapat mungkin, sedangkan untuk perlakuan aerob tidak dialiri gas CO2 dan penutupnya menggunakan kapas. Jumlah botol yang harus disediakan adalah 12 buah botol untuk perlakuan aerob dan 12 botol perlakuan anaerob (10 botol untuk enrichment dan 2 botol untuk yang langsung). Botol yang sudah terisi media tersebut disterilkan dengan autoclave pada suhu 121 ⁰C, tekanan 15 Psi selama 15 menit.

Kegiatan selanjutnya adalah memasukkan sebanyak 10 ml cairan rumen kerbau ke dalam botol dan diinkubasi pada suhu 39 ⁰C selama dua hari. Setelah itu dihitung populasi mikroba rumen untuk perlakuan langsung, sedangkan untuk perlakuan pengayaan maka dilakukan penyegaran dengan cara mengambil 10 ml sampel dari botol I diinokulasikan ke dalam botol II. Penyegaran kultur dilakukan setiap dua hari sekali hingga penyegaran ke-4 (hari ke-10).

c. Tahap isolasi dan perhitungan populasi mikroba rumen

Isolasi bakteri dilakukan dengan cara pengenceran berseri dari sampel/botol hari kedua inkubasi (perlakuan langsung) dan kultur penyegaran ke-4 (perlakuan pengayaan/enrichment). Proses pengenceran dilakukan dengan cara mengambil 0.5 ml dari setiap kultur yang dimasukkan ke dalam media pengenceran hingga 5 seri yaitu 10^-2, 10^-4, 10^-6, 10^-8, 10^-10. Setelah dilakukan pengenceran, diambil 0.1 ml dari masing-masing tahap pengenceran, untuk ditumbuhkan ke dalam media agar. Media agar dalam tabung dalam keadaan cair, kemudian dipadatkan dan diratakan dengan menggunakan pemutar tabung. Selanjutnya kelima tabung diberi label dan dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 39 ⁰C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan perhitungan populasi

18 mikroba rumen meliputi total bakteri, bakteri selulolitik dan fungi seluloltik. Adapun prosesnya dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Proses pengenceran berseri dan inokulasi pada media padat. Perhitungan fungi selulolitik juga hampir sama dengan cara perhitungan bakteri, hanya saja berbeda pada media pengenceran berseri yang diambil yaitu 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7. Populasi bakteri dan fungi dihitung dengan rumus sebagai berikut :

n

Populasi bakteri = --- 0.5 x 10 ^a x 10 ^-1 Keterangan : n = jumlah koloni bakteri

a = faktor pengencer (1,2, 3, 4, dan 5)

Perlakuan yang menunjukkan populasi mikroba rumen terbanyak, akan dipilih sebagai prosedur terbaik dalam pembuatan probiotik berasal dari cairan rumen kerbau. Tahap akhir dari proses pembuatan probiotik berbahan dasar cairan rumen kerbau adalah melakukan sentrifius dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit dari sampel yang diperoleh dari perlakuan terbaik. Residu yang dihasilkannya kemudian ditambah bahan pengisi (onggok), sehingga populasi bakteri yang diharapkan mencapai 2.9 x10⁹ sel/gram.

Hasil penelitian pendahuluan terhadap proses pembuatan probiotik yang berasal dari cairan rumen kerbau disajikan pada Tabel 2 berikut.

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 10^-4 10^-6 10^-8 10^-10 10^-2

Media Putih (volume = 4.5 ml)

19 Tabel 2 Pengaruh perlakuan terhadap rataan populasi mikroba rumen kerbau

(sel/ml) pada penelitian pendahuluan

Parameter Proses ^Perlakuan

Langsung Enrichment Total Bakteri Anaerob 4.1 x10¹⁰ 7.5 x10¹¹

Aerob 2.49 x10¹⁰ 1.26 x10¹¹

Bakteri Selulolitik Anaerob 1.02 x10¹⁰ 5.12 x10¹¹

Aerob 5.7 x10⁹ 5.9 x10¹⁰

Fungi Selulolitik Anaerob 6.3 x10³ 1.46 x10⁵

Aerob - 1.7 x10³

Berdasarkan pengamatan secara numerik terhadap data pada Tabel 2, terlihat rataan populasi mikroba rumen domba optimal ditunjukkan oleh perlakuan enrichment (yang diperkaya) dengan menggunakan proses anaerob. Total bakteri yang dicapai perlakuan tersebut mencapai 7.5 x10¹¹ sel/ml, sedangkan populasi bakteri selulolitik dan fungi selulolitik masing-masing mencapai 5.12 x10¹¹ sel/ml dan 1.46 x10⁵ sel/ml. Hasil ini menjadi tolok ukur dalam penentuan metode yang digunakan untuk pembuatan probiotik yang berasal dari mikroba rumen kerbau.

Pencampuran Probiotik dengan Suplemen Katalitik

Suplemen katalitik dibuat dengan bahan dasar gelatin sagu yang diperkaya dengan mikromineral esensial untuk perkembangan mikroba rumen spesifik penghasil enzim pemecah serat, dengan tambahan preparat probiotik komersil yaitu Probion (produk Balitnak) dan probiotik yang dibuat sendiri berasal dari mikroba rumen kerbau (MRK). Cara pembuatan suplemen katalitik mengikuti prosedur Uhi (2005) yang dimodifikasi. Sedangkan proses pencampuran probiotik dengan suplemen katalitik mengikuti komposisi sebagai berikut.

Tabel 3 Komposisi campuran probiotik dengan suplemen katalitik Komponen Bahan Dasar Komposisi (per gram)

Gelatin sagu (sebagai carrier) 0.5

ZnSO4 7 H2O Equivalen 35 ppm Zn

CoCl2 6 H2O Equivalen 0.2 ppm Co

Urea Equivalen 18 mg

20 Pembuatan campuran probiotik dengan suplemen katalitik meliputi beberapa tahapan, diantaranya adalah: Sagu (Metroxylon sagu) dibuat menjadi gelatin melalui pemanasan pada suhu sekitar 90°C selama 2-3 menit hingga berwarna kecoklatan. Mineral Co dan Zn serta urea ditambahkan pada gelatin sagu tersebut hingga merata. Setelah itu, didinginkan dan dikeringkan, kemudian dihaluskan. Hasil yang diperoleh dari campuran gelatin dengan mineral tersebut kemudian ditambah dengan probiotik.

Uji Biologis Pakan Perlakuan pada Ternak Domba

Ransum penelitian terdiri atas 50% BK hijauan dan 50% BK konsentrat. Jumlah pakan yang diberikan sebanyak 3 % dari bobot badan berdasarkan bahan kering. Hijauan yang digunakan adalah rumput raja dengan komposisi kimia menurut hasil analisis Laboratorium Balai Penelitian Ternak Ciawi (2008) adalah sebagai berikut: Bahan kering (15.49%), protein kasar (6.09%), lemak (1.97%), energi kasar (3641 kkal/kg), dan abu (12.79%). Konsentrat disusun atas dedak padi, molasses-coated palm kernel cake (MCPKC) atau bungkil inti sawit yang sudah mengandung molases, mineral, urea dan garam. Susunan dan komposisi kimia dari konsentrat yang digunakan dapat dilihat lebih jelas pada Tabel 4. Tabel 4 Susunan dan komposisi kimia serta harga konsentrat penelitian

Bahan pakan

Suplementasi campuran probiotik dengan suplemen katalitik pada konsentrat

Harga/kg bahan pakan Kombinasi I Kombinasi II 0.5% 1.0% 0.5% 1.0% (Rp) --- % --- Dedak padi 56 56 56 56 1100 MCPKC 40.5 40 40.5 40 1500 Urea 0.5 0.5 0.5 0.5 1200 Ultra mineral 1.5 1.5 1.5 1.5 10500 Garam 1 1 1 1 1000

Campuran probiotik dengan

suplemen katalitik ^{0.5 1 0.5 1 15000}

Jumlah 100 100 100 100

Komposisi Kimia ^*)

Bahan kering (%) 88.41 88.32 88.23 88.50 Protein kasar (%) 13.21 12.91 13.33 12.88 Energi kasar (kkal/kg) 4030 4081 4047 4027 Harga konsentrat (Rp/kg) 1472 1540 1472 1540 Keterangan :

*)

Hasil analisis laboratorium Balai Penelitian Ternak Ciawi (2008) Kombinasi I: Mengandung probion + suplemen katalitik

21 Penelitian in vivo dilakukan menggunakan domba jantan muda Priangan sebanyak 16 ekor, dengan rataan bobot awal 18 kg. Ternak ditempatkan pada kandang individu berukuran 1.2 x 1.0 m². Pengamatan dilakukan setelah terlebih dahulu dilakukan masa adaptasi selama 3 minggu.

Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 2 dengan empat ulangan dan setiap ulangannya terdiri dari satu ekor domba. Faktor A adalah dua jenis probiotik yang dicampur dengan suplemen katalitik, sedangkan Faktor B adalah dua level persentase penggunaan dari campuran probiotik dengan suplemen katalitik pada konsentrat (0.5% dan 1.0%). Total jumlah ternak yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 16 ekor. Analisis data menggunakan sidik ragam (ANOVA). Apabila hasil uji tersebut berbeda nyata, maka dilanjutkan dengan uji ortogonal kontras (Steel & Torrie 1991). Model matematik analisis ragam sebagai berikut :

Y

ijk

= µ + α

i

+ β

j

+ (αβ)

ij

+ ε

ijk

dimana : Y ijk = Nilai pengamatan k pada taraf ke-i dari faktor A dan taraf ke-j

dari faktor B

µ = Rataan umum

αi = Pengaruh faktor A level ke-i

βj = Pengaruh faktor B level ke-j

(αβ)ij = Pengaruh interaksi faktor A level ke-i, faktor B level ke-j

εijk = Pengaruh galat yang timbul pada pengamatan k yang

memperoleh taraf ke-i dari faktor A dan taraf ke-j dari faktor B

Peubah Yang Diukur

Uji in-vivo dilakukan selama tiga bulan ditambah masa adaptasi tiga minggu. Adapun parameter yang diukur meliputi :

a. Konsumsi Pakan

Konsumsi bahan kering pakan diukur dari jumlah bahan kering pakan yang diberikan dikurangi dengan bahan kering sisa yang tidak dimakan. Pengukuran dilakukan setiap hari selama penelitian.

b. Pertambahan bobot badan

Nilai pertumbuhan domba diukur sebagai selisih antara bobot badan akhir dan bobot badan awal dari domba percobaan.

22

c. Konversi Pakan

Tujuan pengukuran ini adalah untuk menilai kualitas pakan, dan diukur dengan perhitungan sebagai berikut : Konversi pakan = bahan kering pakan yang dikonsumsi per unit pertambahan bobot badan (Tillman et al. 1991).

d. Kecernaan pakan

Kecernaan pakan yang dimaksud dalam penelitian ini adalah kecernaan pakan semu. Tujuan pengukuran ini adalah untuk menilai daya cerna pakan yang terdiri atas: kecernaan bahan kering (KCBK), kecernaan protein (KCP) dan kecernaan serat deterjen netral (KNDF).

Pengamatan kecernaan pakan dilakukan dengan metode koleksi total selama tujuh hari. Koefisien cerna pakan diukur dengan menampung feses selama tujuh hari berturut-turut. Feses ditampung, ditimbang lalu diambil sample sebanyak 10%, dan dikomposit per ternak untuk disimpan pada temperatur -25 ⁰C untuk analisa selanjutnya. Perhitungan koefisien cerna mengacu pada Tillman et al. (1991), yaitu:

Zat makanan yang dikonsumsi – Zat makanan dalam feses

Kecernaan = --- x 100% Zat makanan yang dikonsumsi

e. Karakteristik rumen (pH, NH3, VFA)

ƒ Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan alat pH meter. Pertama, cairan rumen diambil dengan menggunakan Stomach tube. Kemudian cairan rumen dimasukkan sampai ukuran setengah ke gelas piala. Alat pH meter yang akan digunakan dikalibrasi terlebih dahulu dengan pH standar (buffer), kemudian katoda dimasukkan ke dalam cairan rumen dan dilihat nilainya di layar monitor.

ƒ NH₃ diukur denganmenggunakan metode mikrodifusi Conway (Abdelsamie

et al. 1990)

ƒ Analisis konsentrasi VFA total dihitung menggunakan metode penyulingan uap (General Laboratory Procedure 1966), sedangkan analisis konsentrasi VFA parsial dilakukan dengan menggunakan teknik kromatografi gas. Cairan rumen domba yang diambil dengan Stomach tube segera disentrifius pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit, untuk diambil supernatannya. Setelah itu sebanyak 2 ml supernatan di pipet ke dalam tabung plastik kecil

23 yang bertutup. Ke dalam tabung tersebut ditambahkan sebanyak 30 mg 5-sulphosalicylic acid (C6H3(OH) SO3H 2H2O) lalu dikocok. Kemudian disentrifius dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, lalu disaring dengan milipore dan diperoleh cairan jernih. Sebanyak 1 µl cairan jernih diinjeksikan ke dalam gas khromatografi, sebelum diinjeksi sampel terlebih dahulu diinjeksi larutan VFA standar. Perhitungan konsentrasi VFA menggunakan rumus :

Area sampel

C (mM) = --- x konsentrasi standar Area standar

dimana C : konsentrasi asam lemak mudah terbang yang diukur

f. Populasi Mikroba Rumen

Populasi bakteri rumen dicacah menggunakan metode pencacahan koloni. Bakteri yang dicacah hanya yang hidup. Prinsip perhitungannya adalah cairan rumen diencerkan secara serial lalu dilakukan pembiakan bakteri dalam tabung Hungate selama tujuh hari. Kultivasi bakteri dilakukan pada pH 7, dibuat suasananya anaerob dan pada suhu 39 ⁰C. Media pembiakan yang digunakan adalah non selektif media untuk total bakteri, sedangkan untuk selulolitik dan fungi adalah selobiosa. Sedangkan populasi protozoa rumen dihitung berdasarkan teknik pewarnaan dengan menggunakan Trypan Blue Formalin Salin (TBFS). Prosedur perhitungan populasi mikroba rumen dilakukan menurut Ogimoto dan Imai (1981).

g. Income over feed cost (IOFC)

Tujuan perhitungan ini adalah untuk mengetahui penerimaan yang diperoleh dari penjualan ternak setelah dikurangi biaya pakan. Beberapa asumsi yang digunakan dalam perhitungan ini meliputi: harga pakan dan pertambahan bobot badan, serta harga jual domba per kg bobot hidup yang berlaku sekarang.