Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi menggunakan kit platinum dari Invitrogen dan memerlukan bahan-bahan seperti gen penyandi kitinase, primer spesifik Gateway KTN-F, primer spesifik Gateway KTN-R, M13-R, M13-F, larutan bufer, MgCl2, dNTPs, Taq polimerase, dan
molecular water (aquabides). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis yaitu gel agarosa (Sigma), bufer Tris-Borate-EDTA (TBE) 0.5x, Etidium bromida (EtBr) 5 µg/100ml, loading buffer (Bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 kb plus DNA Ladder (Invitrogen). Ekstraksi dan Pemurnian menggunakan kit platinum dari Invitrogen (PureLinkTM Quick Gel Extraction). Isolasi DNA plasmid menggunakan kit dari Fermentas (GeneJETTM Plasmid MiniPrep Kit). Bahan lainnya yang digunakan yaitu Gateway® Technology, Invitrogen (vektor pDONRTM, enzim BP clonaseTM, proteinase K, enzim LR clonaseTM), sel kompeten Escherichia coli galur XL-1 Blue, sel kompeten Agrobacterium tumefaciensgalur AGL-0, media Luria Bertani (LB), media Luria Agar (LA), nitrogen cair, media YEP (Yeast Extract Pepton), larutan bufer 10x dream Taq, larutan bufer TE, kanamisin 100.000 ppm, dan rifampisin 25.000 ppm.
Alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir dan cetakan agar, bak elektroforesis, mikropipet, microwave, tabung mikro, adaptor 100 Volt, transluminator ultraviolet (UV) T2201 (Sigma). Alat lain yang digunakan adalah mesin PCR (ESCO Swift max), DNA speed vacum 110 savant, inkubator bergoyang, laminar air flow cabinet, segitiga penyebar, pinset, pisau potong (scalpel), autoklaf, Eppendorf sentrifus 5417R, neraca analitik, dan peralatan-peralatan gelas seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, labu takar, dan gelas ukur.
Metode
Penelitian sebelumnya oleh Novianthy (2009) telah dilakukan sampai kemudian didapatkan pengurutan basa nukleotida gen penyandi kitinase. Penelitian ini dimulai dari amplifikasi gen penyandi kitinase dengan primer Gateway sampai transformasi ke Agrobacterium sp.
Amplifikasi Gen Penyandi Kitinase dengan Primer Gateway (Invitrogen 2010)
Amplifikasi gen penyandi kitinase menggunakan kit dari Invitrogen (Platinum® Taq DNA Polimerase). Amplifikasi ini menggunakan sepasang primer spesifik Gateway yakni, Gateway KTN-Forward (KTN-F) dan Gateway KTN-Reverse (KTN- R). Proses amplifikasi dimulai dengan menyiapkan campuran reaksi yang terdiri atas 2.5 µL bufer, 1 µL MgCl2, 1 µL dNTPs, 0.2
µL Taq polimerase, dan 14.3 µL aquabides. Siapkan tabung mikro kemudian tambahkan 3 µL aquabides. DNA cetakan (template) dimasukkan ke dalam tabung mikro sebanyak 1 µL. Primer Forward(KTN-F) ditambahkan sebanyak 1 µL ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan pula sebanyak 1 µL Primer Reverse (KTN-R) ke dalam tabung. Campuran reaksi yang telah dipersiapkan sebelumnya ditambahkan sebanyak 19 µL ke dalam larutan DNA.
Gen penyandi kitinase diamplifikasi dengan mesin PCR sebanyak 35 siklus dengan program PCR diantaranya adalah predenaturasi pada suhu 94oC selama 7 menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 45 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 55oC selama 45 detik, pemanjangan primer (extension) pada suhu 72oC selama 2 menit, dan pascapemanjangan pada suhu 72oC selama 5 menit. Verifikasi produk PCR pada gel agarosa 1%.
Elektroforesis Hasil Amplifikasi
Membuat Gel Agarosa Konsentrasi 1%.
Larutkan serbuk agarosa sebanyak 0.3 gram dalam 30 ml larutan TBE 0.5x. Larutan agarosa kemudian dipanaskan dalam microwavesampai larut ± 1 menit. Diamkan larutan sampai terasa hangat, lalu tambahkan larutan EtBr sebanyak 1.5 µL. Larutan yang telah ditambahkan EtBr dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga mengeras membentuk gel. Gel agarosa yang telah mengeras digunakan untuk elektroforesis gen hasil amplifikasi.
Elektroforesis Hasil Amplifikasi. Gen yang telah diamplifikasi dengan PCR
7
selanjutnya dielektroforesis untuk mengetahui gen tersebut telah teramplifikasi atau tidak. Hasil amplifikasi diambil sebanyak 5 µL, kemudian dicampurkan dengan loading buffer sebanyak 1 µL. Campuran tersebut kemudian dimasukkan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa dan dielektroforesis pada 75 volt selama ± 1 jam.
Ekstraksi dan Pemurnian DNA (Invitrogen 2010)
Elektroforegram positif ditunjukkan dengan adanya pita pada gel setelah diamati dengan transluminator UV. Proses ekstraksi dan pemurnian gen penyandi kitinase dari gel dilakukan dengan menggunakan kit dari Invitrogen. Pita yang terang pada gel agarosa dipotong dengan scalpel di bawah transluminator UV. Gel hasil potongan ditambahkan bufer pelarut (Gel solubilisation buffer) sebanyak 3x volume kemudian diinkubasi pada suhu 500C selama 10 menit sampai gel tersebut larut lalu inkubasi lagi pada suhu ruang selama 5 menit. Gel yang telah larut dipindahkan ke kolom (Quick Gel Extraction) dan sentrifus 1 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dibuang, lalu sebanyak sebanyak 500 µL bufer pencuci (wash buffer) ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifus 1 menit pada 12000 rpm, suhu ruang. Supernatan dibuang dan disentrifus kembali dalam keadaan kosong pada kecepatan 12000 rpm, suhu 25oC selama 1 menit. Bufer elusi selanjutnya ditambahkan sebanyak 30 µL tepat ditengah kolom dan inkubasi selama 1 menit pada suhu ruang. Sentrifus kembali larutan tersebut pada kecepatan 12000 rpm, suhu 25oC selama 2 menit. Hasil ekstraksi dan pemurnian gel dilihat dengan elektroforesis gel agarosa.
Rekombinasi Gen Penyandi Kitinase pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi (Invitrogen 2003)
Rekombinasi gen penyandi kitinase pada vektor donor dimulai dengan menyiapkan sebanyak 5 µL bufer TE kemudian tambahkan 2 µL DNA hasil pemurnian, lalu vektor donor (pDONR 221TM) sebanyak 1 µL. Penambahan BP ClonaseTM sebanyak 2 µL setelah semuanya telah siap kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 250C. Larutan kemudian ditambahkan sebanyak 1 µL proteinase K dan diinkubasi lagi pada suhu 370C selama 15 menit. Hasil rekombianasi pada vektor destinasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli. yang
tumbuh pada media LA dikonfirmasi dengan metode PCR. Koloni bakteri rekombinan ditandai adanya pita setelah pengujian dengan metode PCR. Koloni bakteri rekombinan kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk direkombinasikan ke vektor destinasi.
Plasmid rekombinan sebanyak 1 µL dimasukkan ke dalam tabung mikro dan ditambahkan 1 µL vektor destinasi, kemudian tambahkan bufer TE hingga volume larutan mencapai 8 µL. LR ClonaseTM ditambahkan sebanyak 2 µL ke dalam tabung mikro kemudian diinkubasi pada suhu 250C selama 1 jam. Larutan kemudian ditambahkan 1 µL proteinase K setelah inkubasi yang berfungsi menghilangkan protein yang ada pada DNA. Larutan yang telah ditambahkan proteinase K diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 15 menit. Hasil kombianasi kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli. Koloni bakteri yang tumbuh diisolasi DNA plasmidnya kemudian dikonfirmasi dengan metode PCR. Plasmid rekombinan hasil rekombinasi selanjutnya ditransformasikan ke Agrobacterium sp.
Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue
Sebanyak 5 µL hasil rekombinasi ditransformasikan ke dalam 200 µL sel kompeten E.coli XL-1 Blue dan dikocok perlahan hingga tercampur rata kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Larutan hasil rekombinasi dan sel kompeten diberi kejut panas (heat shock) pada suhu 42oC selama 50 detik yang selanjutnya segera dimasukkan ke dalam es selama 10 menit. Sebanyak 800 µL Luria Bertani (LB) dan glukosa 20 mM ditambahkan ke dalam larutan hasil rekombinasi dan sel kompeten kemudian diinkubasi ke dalam inkubator bergoyang selama 1.5 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 150 rpm. Campuran tersebut diambil sebanyak 100 µL (1/10 volume) untuk ditumbuhkan dalam media LA yang mengandung kanamisin 50 ppm dan sisanya sebanyak 9/10 volume disentrifugasi pada 3500 rpm, 25oC selama 5 menit. Supernatan kemudian dibuang ± 800 µL sedangkan sisa supernatan sebanyak 100 µL dan pelet diresuspensi lalu ditumbuhkan dalam media LA yang mengandung kanamisin 50 ppm dan meratakannya dengan segitiga penyebar. Media diinkubasi dalam kondisi 37oC selama 16-20 jam kemudian dilihat hasil koloni yang tumbuh. Media LA yang digunakan terdiri atas tripton 10 g/L, yeast extract5 g/L, NaCl 5 g/L dan bakto agar 15 g/L.
Konfirmasi Koloni Transforman dengan Teknik PCR Koloni
Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi dianalisis dengan metode PCR koloni. Koloni yang tumbuh pada media LA diambil dengan menggunakan tusuk gigi kemudian dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf. Pemindahan koloni dilakukan secara steril dalam laminar air flow cabinet. Persiapan PCR koloni dilakukan dengan menyiapkan campuran reaksi sebanyak total tabung yang berisi koloni yang terdiri atas, aquabides 2.75 µL, buffer complete 1.5 µL, dNTPs 0.3 µL, M13-F 0.15 µL, M13-R 0.15 µL, Taq polimerase 0.15 µL. Tahap pertama PCR adalah program lisis 96oC selama 5 menit, 50oC selama 1 menit 30 detik, 96oC selama 1 menit 30 detik, 45oC selama 1 menit 30 detik, 96oC selama 1 menit, dan 40oC selama 1 menit. Program dihentikan sejenak untuk penambahan sebanyak 5 µL campuran reaksi ke dalam masing-masing tabung Eppendorf. Program PCR kemudian dilanjutkan kembali dengan program PCR yakni, 94oC selama 30 detik, 55oC selama 1 menit, 72oC selama 2 menit. Koloni transforman setelah perbanyakan dengan teknik PCR selesai kemudian dielektroforesis dengan gel agarosa 1%.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006)
Isolasi DNA plasmid dilakukan berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang diketahui mengandung plasmid terinsersi fragmen yang diinginkan. Plasmid diisolasi dengan GeneJetTM Plasmid Miniprep Kit. Koloni bakteri yang tumbuh pada media LA dikulturkan ke media LB yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm (bakteri yang ditransformasikan dengan vektor donor). Bakteri diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu 370C selama semalam untuk pembiakan bakteri. Sampel yang positif mengandung plasmid terinsersi disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm terlebih dahulu. Pelet dihomogenisasi dengan penambahan 250 µL larutan resuspensi kemudian divortex. Pelet yang telah dilarutkan tersebut ditambahkan larutan lisis sebanyak 250 µL dan dikocok bolak-balik. Sebanyak 350 µL larutan netralisasi ditambahkan ke dalam larutan tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan dan suhu yang sama selama 5 menit. Kecepatan sentrifugasi pada isolasi DNA plasmid dengan kit Fermentas seluruhnya pada 12000 rpm dan
suhu 250C. Setiap penambahan larutan dalam tabung dibolak-balik sebanyak 6x.
Supernatan dipindahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi selama 1 menit. Kolom dicuci dengan 500 µL larutan pencuci dan disentrifus selama 1 menit (dilakukan sebanyak 2x). Kolom dalam keadaan kosong disentrifus kembali selama 1 menit. Kolom dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambahkan 30 µL elution buffer tepat di tengah membran kolom. Kolom diinkubasi selama 2 menit dan disentrifugasi kembali selama 2 menit. DNA plasmid diverifikasi pada gel agarosa 1%.
Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciensGalurAGL-0
Sebanyak 10 µL DNA plasmid dimasukkan ke dalam Agrobacterium galur AGL-0lalu didiamkan di dalam es selama 15 menit. Inkubasi kembali di dalam nitrogen cair selama 5 menit dan pada suhu 37oC selama 5 menit. Tambahkan 1 ml YEP (Yeast Exctract Pepton) lalu dikocok dengan inkubator bergoyang selama 3 jam pada suhu 28oC. Larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 3 menit.
Supernatan yang dihasilkan sebagian dibuang dan sebanyak ± 200 µL supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet yang terbentuk lalu disebar ke dalam media LB yang telah berisi antibiotik kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm. Inkubasi selama 2 hari pada suhu 280C dalam kondisi gelap.