Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bagian Ruminansia Besar dan Labolatorium Ilmu Produksi Ternak Perah Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung dalam dua tahap yaitu tahap pertama dari bulan Januari sampai Maret 2008 untuk pemeriksaan kemurnian BAL, pertumbuhan pada suhu berbeda dan pertumbuhan pada NaCl 6,5%. Tahap kedua pada bulan November sampai Desember 2009 untuk pengujian terhadap sensitivitas antibiotik.
Materi Bahan
Bahan–bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah 28 isolat bakteri asam laktat yang berasal dari daging sapi. Isolat bakteri didapat dari daging yang dijual di empat pasar yang berada di Bogor : pasar Anyar (1A1, 1A2, 1A4, 1A5, 1A6, 1A32, 2A1, 2A2 dan 2A3), pasar Cibeureum (1B1, 1B2, 2B1, 2B2, 2B3 dan 2B4), pasar Gunung Batu (1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 2C2 dan 2C12) dan pasar Ciampea (1D1, 1D2, 1D3, 2D1, 2D2, D41 dan 2D42) (Hidayati, 2006).
Media yang digunakan adalah deMan Rogosa Sharp Agar (MRSA), deMan
Rogosa Sharp Broth (MRSB), Yeast extract, Buffer Peptone Water (BPW),
antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol, NaCl, H2O2, alkohol, kristal violet, iodin,
safranin, minyak imersi dan akuades.
Alat
Peralatan yang digunakan adalah tabung reaksi, cawan petri, ose, inkubator,
kompor listrik, bunsen, kapas, alumunium foil, karet, plastik HDPE, panci, gelas
objek, cawan petri, tabung reaksi, vortex, oven, autoclave, termometer, rak tabung
reaksi, pipet dan alat gelas lain.
Rancangan
Rancangan yang digunakan untuk uji pertumbuhan pada media NaCl 6.5% adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan faktor perlakuan yaitu 28 jenis bakteri asam laktat yang diberi perlakuan NaCl dengan konsentrasi 6,5% yang dilakukan 3 kali pengulangan yang dikelompokkan. Rancangan untuk uji sensitifitas terhadap antibiotik adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 3x2 dengan 3 kali
14 ulangan. Faktor pertama adalah jenis isolat bakteri asam laktat yang berbeda yaitu 1B1, 2B4 dan 1A5. Faktor kedua adalah antibiotik yang diberikan yaitu kloramfenikol dan amoksisilin.
Model matematis yang digunakan untuk Rancangan Acak Lengkap (RAL) berdasarkan Steel and Torrie (1995) :
Yij = μ + τi + εij
Keterangan :
Yij = variabel yang akan dianalisis
μ = nilai rataan umum
τi = pengaruh 28 kultur bakteri asam laktat
εij = galat percobaan
Peubah yang diamati adalah jumlah populasi akhir setelah ditumbuhkan pada NaCl 6,5%. Data yang didapat dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Jika berbeda nyata dilakukan uji lanjut Tukey (Steel dan Torrie, 1995).
Model matematis yang digunakan untuk Rancangan Acak Lengkap pola faktorial 3x2 berdasarkan Steel and Torrie (1995) :
Yijk = µ + αi + βj + (αβ) ij + ε ijk Keterangan :
Yijk = variabel yang akan dianalisis
µ = nilai rataan umum
αi = pengaruh faktor I pada taraf ke-i; i = 1B1, 2B4 dan 1A5
βj = pengaruh faktor II pada taraf ke- j; j = antibiotik amoksisilin dan
kloramfenikol
(αβ) ij = interaksi antara faktor I pada taraf ke-i dan faktor II pada taraf ke-j
ε ijk = galat percobaan
Peubah yang diamati adalah jumlah kematian akibat antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol. Data yang didapat dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Jika terjadi interaksi dan hasilnya berbeda nyata dilakukan uji lanjut Tukey (Steel dan Torrie, 1995).
15
Prosedur Pemeriksaan Kemurnian Bakteri Asam Laktat
Kultur starter yang telah diisolasi dari daging sapi pada penelitian sebelumnya di konfirmasi kembali untuk memastikan kemurniannya dengan cara
ditumbuhkan pada media deMan Rogosa Sharp Agar (MRSA) dengan metode
striking dan di inkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam, kemudian diambil satu
koloni yang dianggap sebagai koloni bakteri asam laktat dan dimasukan ke deMan
Rogosa Sharp Broth (MRSB), kultur ini disebut kultur stok. Setiap kultur stok dilakukan penyegaran pada media MRSB sebelum dilakukan pengujian. Sebanyak 1 ml kultur diinokulasikan ke dalam media MRSB. Kultur kemudian diinkubasi pada
suhu 37 oC selama 24 jam yang hasilnya disebut kultur kerja. Kultur kerja ini yang
digunakan untuk mengkonfirmasi bakteri uji. Uji yang dilakukan adalah uji katalase dan pewarnaan Gram.
1) Uji Katalase (Lay, 1994)
Sebanyak 1 ose isolat dioleskan pada gelas objek yang telah disterilkan dengan
alkohol. Gelas objek kemudian ditetesi larutan H2O2 3%. Preparat diamati, bila
terjadi gelembung gas maka menunjukkan bakteri dengan katalase positif dan apabila tidak terbentuk gelembung gas bakteri tersebut katalase negatif. Semua bakteri uji dilakukan pengulangan sebanyak 4 kali ulangan.
2) Pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1990). Sampel bakteri dari koloni yang
homogen dioleskan pada kaca objek kemudian difiksasi panas. Olesan bakteri kemudian diteteskan dengan kristal violet selama satu menit, kemudian diratakan, dibilas dengan akuades dan dikering udarakan. Setelah kering, olesan bakteri
diteteskan iodium dan diratakan kembali, keringkan udara selama dua menit,
kemudian dibilas akuades dan ditiriskan. Preparat dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik, kemudian dicuci segera dengan akuades dan ditiriskan. Preparat selanjutnya diteteskan safranin selama 30 detik, dibilas dengan akuades dan ditiriskan. Setelah kering preparat diteteskan minyak imersi dan diamati dibawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna dunding sel setelah dilakukan pewarnaan. Bakteri yang termasuk dalam
16 kelompok Gram positif akan menunjukkan warna ungu atau gelap sedangkan kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah safranin.
Perlakuan
1) Pertumbuhan pada Suhu 15 ºC, 37 ºC dan 45 ºC (Harrigan dan Mc. Cance, 1988)
Sampel kultur kerja bakteri asam laktat umur 24 jam masing-masing diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan dalam 9 tabung reaksi yang sudah berisi
MRSB sebanyak 9 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 15 ºC dan 45 ºC selama
24-48 hari. Kontrol adalah tabung dengan kultur yang sama diinkubasi pada suhu
37ºC. Pengujian terhadap suhu pertumbuhan BAL dilakukan triplo. Hasil positif
atau adanya pertumbuhan ditunjukkan dengan terbentuknya kekeruhan, Kekeruhan yang terjadi menyatakan kemampuan BAL tumbuh pada suhu yang diujikan. Bila tidak terdapat pertumbuhan yang ditunjukkan dengan media tetap bening atau sama dengan media MRSB maka diberi tanda negatif.
2) Pertumbuhan pada NaCl 6,5% (Harrigan dan Mc. Cance, 1988)
Pengujian dilakukan untuk mengetahui toleransi bakteri asam laktat terhadap NaCl dengan konsentrasi 6,5%. Kultur kerja bakteri asam laktat dihitung populasi awalnya terlebih dahulu dengan cara mengambil 1 ml kultur bakteri asam laktat dimasukan dalam tabung reaksi yang sudah mengandung 9 ml BPW
untuk menghasilkan pengenceran 10-1. Selanjutnya dilakukan pengenceran
desimal hingga diperoleh pengenceran 10-9. Pemupukan dilakukan dengan cara
memupukan 1 ml pengenceran 10-7, 10-8 dan 10-9 pada media MRSA sebanyak
12 ml dalam cawan Petri steril secara duplo.
Kultur kerja bakteri asam laktat umur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1ml dalam media MRSB yang mengandung NaCl dengan konsentrasi 6,5%. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24-48 jam yang dilakukan secara triplo. Hasil yang positif ditunjukan dengan terbentuknya kekeruhan atau adanya endapan dan selanjutnya dihitung populasinya. Cara menghitung populasinya sama seperti
17
3) Uji Sensitifitas terhadap Antibiotik
Uji dilakukan pada bakteri-bakteri dengan kemampuan tumbuh pada suhu sedang atau pada bakteri mesofil. Bakteri mesofil ini memberikan respon yang berbeda pada suhu pertumbuhan 15 ºC. Bakteri tersebut adalah isolat 1B1, 2B4 dan 1A5. Pemilihan isolat uji juga berdasarkan kemampuan ketahanannya terhadap garam empedu dan pada suasana asam yaitu pada pH 2 (Wijayanto, Unpublished). Bakteri tersebut dikarakterisasikan berdasarkan sensitifitas terhadap antibiotik khususnya amoksisilin dan kloramfenikol dengan menumbuhkan kultur 2B4, 1A5 dan 1B1 ke dalam media yang ditambahkan dengan masing-masing antibiotik dengan konsentrasi dalam larutan 0,25 gram/ml yang diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 ºC yang sebelumnya dilakukan perhitungan populasi awal dan kemudian dihitung kembali jumlah bakteri yang masih bertahan dalam kondisi tersebut. Perhitungan yang dilakukan seperti perhitungan yang dilakukan pada uji pertumbuhan pada NaCl 6,5%, faktor pengenceran yang dilakukan pada perhitungan uji sensitifitas pada antibiotik untuk perhitungan
awal faktor pengencerannya 10-9 dan untuk perhitungan akhirnya faktor