Penelitian ini telah dilakukan dari bulan November 2007 sampai dengan Januari 2008 di Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah dan Bagian Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan dan Laboratorium Diagnostik Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Materi Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan pembuatan susu fermentasi dan bahan untuk analisis. Bahan untuk pembuatan susu fermentasi meliputi susu segar, starter bakteri asam laktat yaitu
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus dan Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, starter kerja biji kefir serta Bifidobacterium longum koleksi Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah, Departemen Ilmu Produksi Ternak, Fakultas Peternakan IPB, dan isolat bakteri patogen Staphylococcus aureus asal susu kambing perah hasil isolasi Taufik (2007). Bahan yang digunakan untuk analisis meliputi MRSA (de Mann Rogosa Sharpe Agar), BPA (Baird Parker Agar) yang ditambah egg yolk tellurite, Nutrient Broth, Buffer Peptone Water (BPW), standar larutan 0,5 McFarland, NaCl fisiologis, alkohol, aquadestilata dan kapas steril. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat untuk pembuatan susu fermentasi dan alat untuk analisis. Alat untuk pembuatan susu fermentasi meliputi panci, kompor, pipet, tabung reaksi, autoklaf, inkubator, pembakar Bunsen, botol kaca, gelas ukur dan tabung Erlenmeyer. Alat untuk analisis meliputi cawan Petri, pipet, mikropipet, tabung reaksi, autoklaf, pembakar Bunsen, jarum Ose, inkubator, refrigerator, pengaduk gelas, hockey stick, vortex, pH meter, dan buret.
Rancangan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola searah dengan tiga kali ulangan. Perlakuan berupa perbedaan kultur starter susu fermentasi yang terdiri atas:
YT+SA = susu steril + bakteri SA dengan starter yogurt
YP+SA = susu steril + bakteri SA dengan starter yogurt probiotik KF+SA = susu steril + bakteri SA dengan starter kefir
KSA = susu steril + bakteri SA tanpa starter (kontrol patogen)
Untu melihat pertumbuhan starter tanpa kompetisi dengan bakteri uji dilihat juga kontrol pertumbuhan BAL sebagai berikut :
KYT = susu steril + starter yogurt (kontrol starter Y)
KYP = susu steril + starter yogurt probiotik (kontrol starter YP) KKF = susu steril + starter kefir (kontrol starter K)
Peubah yang dimati adalah pengukuran pH, pengukuran Total Asam Tertitrasi (TAT), serta analisis mikrobiologi yang meliputi jumlah populasi BAL dan jumlah populasi SA. Pengujian dilakukan secara triplo.
Rumus rancangan tersebut adalah
Yij = μ+ αi+εij Keterangan:
Yij = nilai pengamatan (parameter) pada perlakuan taraf ke-i dan ulangan taraf ke-j
μ = nilai tengah umum
αi = pengaruh perlakuan taraf ke-i
εij = galat percobaan pada perlakuan taraf ke-i dan ulangan taraf ke-j i = 1, 2, 3, 4
j = 1, 2, 3, 4
Uji asumsi dilakukan terhadap data. Bila memenuhi asumsi maka data dianalisis dengan uji parametrik (ANOVA), jika data tidak memenuhi uji asumsi maka data dianalisis dengan uji non parametrik (KRUSKAL WALLIS). Jika perlakuan menunjukan pengaruh yang nyata, maka akan dilanjutkan dengan uji
Tukey (parametrik) dan uji beda rataan ranking (non parametrik) (Steel dan Torrie, 1995).
Prosedur Proses Persiapan Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan sebagai bakteri pencemar dalam produk susu fermentasi adalah bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus (SA) asal susu kambing hasil isolasi Taufik (2007). Masing-masing bakteri uji yang akan ditambahkan kedalam produk susu fermentasi harus berada dalam kondisi segar (kultur baru berumur ± 24 jam). Kultur segar disiapkan dengan cara memindahkan isolat yang disimpan dalam tabung effendorf dengan menggunakan ose untuk digoreskan ke atas media selektif untuk masing-masing bakteri dalam cawan, yaitu BPA + egg yolk tellurite untuk SA. Cawan tersebut kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC, jika dalam waktu 24 jam tidak ada koloni yang tumbuh waktu inkubasi diperpanjang sampai 48 jam.
Setelah dilakukan proses inkubasi, dilakukan transfer koloni dari cawan petri ke media cair yaitu Nutrient Broth (NB) steril dengan cara menyentuhkan ujung ose ke empat atau lima koloni terpisah dalam cawan Petri dari masing- masing bakteri uji. Setelah itu ose tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan NB. Tabung tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC. Kultur segar didapatkan setelah proses inkubasi selesai, kultur segar bakteri SA dalam media NB kemudian disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit sampai sel-sel bakteri SA mengendap kemudian supernatan larutan NB dipisahkan dari endapan sel-sel bakteri. Kultur segar distandardisasi terlebih dahulu sebelum ditambahkan ke dalam susu fermenatsi. Standarisasi ini bertujuan untuk mendapatkan kandungan bakteri uji sekitar 108 koloni/ml dengan cara menyesuaikan kekeruhan kultur dengan larutan standar 0,5 McFarland (Perilla et al. 2003). Jika larutan kultur terlalu jenuh maka akan diencerkan dengan larutan BPW, sedangkan jika larutan kurang jenuh maka akan ditambahkan larutan kultur dari tabung lain. Apabila telah sesuai dengan larutan standar 0,5 McFarland, maka larutan kultur siap untuk ditambahkan ke dalam susu fermentasi.
Pembuatan Produk Susu Fermentasi
Pembuatan Yogurt yang Dikontaminasi SA. Metode pembuatan yogurt mengacu pada Tamime dan Robinson (1999). Susu dipanaskan pada suhu 85 - 90oC sampai volumenya menjadi dua pertiga dari volume awal, kemudian susu didinginkan sampai suhu sekitar 42oC. Setelah mencapai suhu tersebut, dalam kondisi aseptik, bibit (starter) dengan konsentrasi 5% diinokulasikan secara merata ke dalam susu dengan perbandingan yang sama antar bibit, pada saat yang sama bakteri patogen yang menjadi bakteri uji juga ditambahkan kedalam susu. Yogurt tipe I (YT+SA) menggunakan bibit LB dan ST, adapun yogurt tipe II menggunakan bibit LB dan ST ditambah dengan BL (YP+SA). Susu yang telah diinokulasi bibit kemudian diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 24 jam.
Pembuatan Kefir yang Dikontaminasi SA. Metode pembuatan kefir (KF+SA) merupakan modifikasi metode yang dijelaskan oleh Gulmez dan Guven (2003b). Susu dipanaskan pada suhu 85oC selama sekitar 30 menit, kemudian susu didinginkan sampai suhu sekitar 30oC. Setelah mencapai suhu tersebut, dalam kondisi aseptik, biji kefir diinokulasikan secara merata kedalam susu dengan konsentrasi 5%, pada saat yang sama bakteri patogen yang menjadi bakteri uji juga ditambahkan kedalam susu. Susu diinkubasi dalam ruang yang kedap cahaya (28oC) selama 24 jam.
Cara Pengambilan Contoh. Untuk setiap bakteri uji yaitu SA, masing-masing susu fermentasi yaitu YT+SA, YP+SA dan K+SA akan dibuat didalam tiga botol steril dengan volume masing-masing sebanyak 300 ml susu steril, 5% starter yang sesuai dan 1% bakteri uji SA sesuai hasil Zuniga et al. (2005). Volume kultur segar bakteri uji yang ditambahkan kedalam setiap botol adalah sebesar 3,15 ml bakteri patogen uji ada di dalam susu. Setelah itu YT+SA, YP+SA, dan KF+SA didistribusikan secara aseptik ke dalam enam botol steril sesuai dengan waktu pengambilan contoh (H0, H3, H5, H7, H9, H11).
Lima botol steril lainnya diisi dengan susu steril + starter untuk yogurt (KYT), susu steril + starter yogurt probiotik (KYP), susu steril + biji kefir (KKF)
(kontrol kultur starter), susu steril + bakteri patogen SA (KSA) (kontrol SA) dan terakhir hanya berisi susu steril (kontrol negatif) (KN).
Starter yang telah selesai ditambahkan pada masing-masing sampel susu kemudian dilakukan inkubasi selama 24 jam. Proses fermentasi selesai, semua botol perlakuan disimpan didalam lemari es dengan suhu sekitar 5oC±2. Semua botol disimpan dalam lemari pendingin selama 11 hari, pengambilan sampel untuk analisis masing-masing peubah dilakukan pada hari ke-0 (akhir fermentasi= jam ke-24), 3, 5, 7, 9 dan 11). Secara umum gambaran pembuatan produk susu fermentasi dan analisi sampel dapat diamati pada Gambar 4.
Peubah yang Diamati
Pengukuran pH (Nielsen, 2003). Alat pH meter yang telah dinyalakan dan distabilkan selama 15-30 menit distandarisasi dengan larutan buffer pada pH 4 dan pH 7. Suhu sampel diukur dan pengatur suhu diset pada suhu tersebut. Elektroda dibilas dan dikeringkan dengan kertas tissu kemudian dicelupkan ke dalam 5 ml sampel. Nilai pH meter dibiarkan hingga menunjukkan suatu angka yang stabil, angka ini dicatat sebagai nilai pH terukur.
Pengukuran TAT (Total Asam Tertitrasi) (Nielsen, 2003). Pengukuran Total Asam Tertitrasi (TAT) pada sampel bertujuan untuk mengukur jumlah asam organik yang terdapat pada sampel tersebut. Sebanyak 10 ml sampel susu fermentasi ditambahkan tiga tetes PP (Fenolftalien) sebagai indikator kemudian campuran tersebut dititrasi menggunakan larutan NaOH (0,1N) hingga terbentuk warna merah muda yang tidak lenyap lagi sewaktu dihomogenkan. Nilai derajat keasaman dapat dihitung dengan mengkonversikan nilai keasaman menjadi persentase asam laktat seperti yang dikemukakan oleh Neilsen (2003).
Starter dimasukkan
Susu steril yang telah dipanaskan dan
memiliki suhu sesuai starter; diaduk
merata dengan pengaduk gelas steril
Bakteri uji dimasukkan
Proses fermentasi selama 24 jam di suhu ruang.
Produk disimpan kedalam lemari es untuk dilakukan analisis lanjutan setiap dua hari (hari ke-0, 3, 5, 7, 9, 11)
Masa akhir penyimpanan (hari ke-11) sekaligus hari terakhir pengambilan sampel untuk analisis
Gambar 4. Gambaran Umum Pembuatan Produk Susu Fermentasi dan Analisis Sampel
Persentase asam laktat dihitung dengan rumus: % Asam Laktat =
V2 × 10 N× V1 × Eq. wt.
Keterangan: N = Normalitas Titran (NaOH) Eq. wt = Berat equivalen asam
(Asam Laktat = 90,08)
V1 = Volume Titran
V2 = Volume Sampel
Analisis Mikrobiologi
Analisis mikrobiologi untuk penghitungan jumlah populasi bakteri akan dilakukan dengan metode Standard Plate Count (SPC) atau metode hitungan cawan. Adapun larutan yang digunakan sebagai pengencer adalah larutan Buffer Peptone Water.
Jumlah Populasi Bakteri Asam Laktat (BAL). Populasi BAL dihitung dengan mengikuti teknik yang dilakukan Djenane et al. (2005) yang diuraikan dalam bagan alir pada Gambar 4.
Pengenceran sampel pada tingkat pengenceran yang sesuai
1 ml inokulum pada tiap pengenceran dimasukkan kedalam cawan petri steril
medium MRS Agar yang telah disiapkan dan disimpan dalam suhu 45oC dituangkan
sebanyak ± 20 ml kedalam cawan
Setelah agar mengeras, sejumlah medium ini dituangkan kembali diatas agar yang telah
mengeras untuk membuat overlayer
Cawan yang telah dinokulasi dan diberi medium kemudian diinkubasi pada suhu 37oC
selama 48 jam/2 hari dengan posisi dibalik
Penghitungan Koloni Gambar 5. Tahapan Populasi Bakteri Asam Laktat
Jumlah Populasi Staphylococcus aureus (SA). Metode inokulasi permukaan (surface inoculation method) akan digunakan untuk menghitung populasi SA, metode ini mengacu kepada standar ISO 6888-1 (ISO, 1999). Uraian lebih lanjut tentang penghitungan populasi SA dalam sampel disajikan pada Gambar 6.
Pengenceran sampel pada tingkat pengenceran yang sesuai
Medium BPA+egg yolk tellurite (BPAet) yang telah mengeras dalam cawan disiapkan, lalu
sebanyak 0,1 ml inokulum pada tiap pengenceran dimasukkan kedalam cawan petri
steril yang telah berisi BPAet
inokulum tersebut disebar di permukaan medium dengan menggunakan hockey stick
steril yang terbuat dari kaca/baja secara merata
Setelah dianggap mengering, semua cawan yang berisi SA disimpan kedalam inkubator secara terbalik untuk diinkubasi selama 2 hari
pada suhu 37oC
Penghitungan Koloni