METODE Lokasi dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah, Fakultas Peternakan IPB, Bogor dan Balai Penelitian Veteriner (BALITVET) Bogor. Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan, mulai dari bulan Desember 2005 sampai bulan Mei 2006.

Materi Bahan

Bahan utama yang digunakan adalah susu kambing yang dibuat menjadi yogurt dengan penambahan bakteri probiotik. Bahan baku merupakan susu dari kambing PESA (Persilangan Peranakan Etawah dengan Saanen) dan dari kambing Saanen yang masing-masing dibuat yogurt probiotik. Susu kambing diperoleh dari peternakan PT Taurus Dairy Farm, Sukabumi. Starter yang digunakan adalah

Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus sebagai kultur asli yogurt serta Bifidobacterium bifidum dan Lactobacillus acidophilus sebagai kultur bakteri probiotik. Semua kultur bakteri merupakan koleksi dari Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah, Fakultas Peternakan IPB, Bogor.

Bakteri uji yang digunakan yaitu bakteri Gram positif (Bacillus cereus BCC 26 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923) dan bakteri Gram negatif (Salmonella thypi BCC 712, Pseudomonas sp. BCC 2268 dan Escherichia coli ATCC 25922). Semua kultur bakteri merupakan koleksi dari Balai Penelitian Veteriner (BALITVET) Bogor, diperoleh dalam bentuk biakan agar.

Media yang digunakan adalah MRSA (deMan Rogosa Sharp Agar) sebagai media pertumbuhan bakteri asam laktat, Mueller Hinton Agar (MHA) untuk media konfrontasi yogurt probiotik dengan bakeri uji dan Tryptone Soya Broth (TSB) yang digunakan untuk media pertumbuhan bakteri uji sedangkan larutan pengencer yang digunakan adalah Buffer Peptone Water (BPW) 1 %.

Alat-alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah plastik HDPE, autoklaf,

waterbath, sterilisator, inkubator, cawan petri, ose, tabung reaksi, refrigerator, pipet, penggaris, jangka sorong, bunsen serta alat-alat gelas.

Rancangan

Rancangan yang digunakan rancangan acak lengkap faktorial (2 x 8) dengan perlakuan berupa bangsa kambing berbeda (Saanen dan PESA) dan lama penyimpanan (0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 dan 49 hari). Percobaan diulang 3 kali. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat yang dihasilkan setelah konfrontasi antara yogurt susu kambing berbeda dengan bakteri uji. Model matematika rancangan tersebut adalah sebagai berikut (Mattjik dan Sumertajaya, 2002) :

Yijk =

μ + α

i

+ β

j

+ αβ

ij

+ ε

ijk

Keterangan :

Y

ijk = Peubah respon karena pengaruh bersama taraf ke-i faktor α (bangsa

kambing) dan taraf ke-j faktor β (lama penyimpanan) pada ulangan ke-k (k = 1,2,3).

μ

= Pengaruh rata-rata

α

i = Pengaruh taraf ke-i faktor

α

(bangsa kambing) (i = 1,2).

β

j = Pengaruh taraf ke-j faktor

β

(lama penyimpanan) (j = 1,2,3,…8).

αβ

ij = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor

α

dan taraf ke-j faktor

β.

ε

ijk = Galat percobaan pada ulangan ke-k pada kombinasi

α

i dengan

β

j dan

interaksi

αβ

ij.

Penentuan sensitivitas spesies bakteri uji menggunakan rancangan acak lengkap faktorial (2 x 5) dengan perlakuan bangsa kambing berbeda (Saanen dan PESA) dan jenis bakteri uji (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella thypi, Pseudomonas sp. dan Escherichia coli). Percobaan diulang 3 kali. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat yang dihasilkan dengan bakteri uji sebelum penyimpanan. Model matematika rancangan tersebut adalah sebagai berikut (Mattjik dan Sumertajaya, 2002) :

Yijk =

μ + α

i

+ β

j

+ αβ

ij

+ ε

ijk

Keterangan :

Y

ijk = Peubah respon karena pengaruh bersama taraf ke-i faktor α (bangsa

kambing) dan taraf ke-j faktor β (jenis bakteri uji) pada ulangan ke-k (k = 1,2,3).

μ

= Pengaruh rata-rata

α

i = Pengaruh taraf ke-i faktor

α

(bangsa kambing) (i = 1,2).

β

j = Pengaruh taraf ke-j faktor

β

(jenis bakteri uji) (j = 1,2,3,…5).

αβ

ij = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor

α

dan taraf ke-j faktor

β.

ε

ijk = Galat percobaan pada ulangan ke-k pada kombinasi

α

i dengan

β

j dan

interaksi

αβ

ij.

Setiap analisis ragam yang memberikan hasil berbeda nyata akan dilanjutkan dengan menggunakan uji LSM (Least Square Means) untuk aktivitas antimikroba yogurt probiotik selama penyimpanan pada masing-masing bakteri uji dan aktivitas antimikroba yogurt probiotik dari susu kambing berbeda pada berbagai bakteri uji. Selain itu, digunakan uji lanjut kontras orthogonal untuk melihat pengaruh kelompok bakteri Gram positif dan Gram negatif.

Prosedur

Penelitian meliputi dua tahap, yaitu tahap penelitian pendahuluan dan tahap penelitian utama.

Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan meliputi preparasi starter, preparasi bakteri uji dan pembuatan yogurt probiotik. Penelitian pendahuluan bertujuan untuk memeriksa kemurnian starter, viabilitas starter dan karakteristik morfologi starter untuk pembuatan yogurt probiotik.

Preparasi Starter. Persiapan starter diawali dengan pemurnian yang dilakukan untuk mendapatkan satu koloni tunggal, kemudian dilakukan pemeriksaan morfologi secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram. Koloni yang telah dimurnikan, ditumbuhkan pada agar miring dan disimpan pada suhu 70C sebagai stock culture. Kultur starter

dibuat dengan menumbuhkan stock culture ke dalam susu skim steril. Kultur starter

diremajakan setiap 7 hari sekali. Masing-masing bakteri dikondisikan pada populasi bakteri 5 x 108 - 1 x 109 per ml (Tamime dan Robinson, 1999).

Preparasi Bakteri Uji. Kultur bakteri uji dipelihara dan diperbanyak dengan mengambil kultur bakteri uji dari biakan agar sebanyak satu ose steril kemudian diinokulasikan dalam media TSB sebanyak 5 ml dan diinkubasi pada suhu 370C

selama 24 jam. Sebelum digunakan, kultur disimpan pada suhu 50C dan disegarkan kembali setiap satu minggu sebagai kultur stok.

Pembuatan Yogurt Probiotik (Tamime dan Robinson, 1999). Susu skim segar dipanaskan sampai 2/3 volume semula pada suhu 850C selama 30 menit. Susu yang telah dipanaskan didinginkan sampai suhu 400C. Bila suhu telah mencapai 400C dilakukan inokulasi starter. Kultur starter ditambahkan sebanyak 3 % dengan 4 jenis bakteri starter dengan perbandingan yang sama. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar (25-300C) selama 24 jam. Yogurt yang telah jadi dikemas dengan plastik HDPE masing-masing 25 ml dan disimpan pada suhu 70C. Yogurt ini telah dimodifikasi karena ditambahkan bakteri yang telah diteliti berfungsi sebagai probiotik, yaitu Bifidobacterium bifidum dan Lactobacillus acidophilus (Nakazawa dan Hosono, 1992). Diagram alir proses pembuatan yogurt probiotik susu kambing ditampilkan pada Gambar 1.

Susu didinginkan hingga mencapai suhu ± 400C

Starter yogurt dan probiotik ditambahkan

Dikemas dengan volume @ ± 25 ml dalam kemasan plastik

HDPE steril

Disimpan dalam refrigerator yang bersuhu 70C selama 49 hari.

Inkubasi pada suhu kamar 300C selama 18-24 jam

Susu kambing skim dipasteurisasi hingga 2/3 volume awal (± 30

menit) suhu 850C

Pengukuran Peubah

Pengukuran pH (DSN, 1992). Nilai pH diukur dengan menggunakan pH-meter setelah terlebih dahulu dikalibrasi dengan buffer pH. Kalibrasi dilakukan setiap saat akan melakukan pengukuran. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan elektroda kedalam sampel setelah dibersihkan dengan air suling dan skala dibaca angka penunjuk pada posisi tetap.

Total Bakteri Asam Laktat (APHA, 1992). Prosedur perhitungan bakteri asam laktat dimulai dengan pengenceran 1 ml yogurt pada 9 ml larutan pengencer (NaCl fisiologis) yang merupakan pengenceran 10-1. Pengenceran 10-2 diperoleh dengan mengambil 1 ml contoh dari pengenceran pertama kedalam 9 ml larutan pengencer. Demikian selanjutnya sampai pengenceran yang kita inginkan. Pemupukan dilakukan dengan mengambil 1 ml larutan dari pengenceran 10-7, 10-8, 10-9 dan dimasukkan kedalam cawan, kemudian ditambahkan media MRSA (deMan Rogosa Sharp Agar) sebanyak 12 ml. Cawan diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 370C selama 24 jam. Setelah proses inkubasi selesai, bakteri asam laktat dihitung dengan mengikuti ketentuan Standar Plate Count (SPC).

Total Asam Tertitrasi (DSN, 1992). Sampel diukur sebanyak 1 ml dilarutkan kedalam air akuadest sebanyak 9 ml. Ditambahkan 2 tetes indikator phenoplitalein (pp 1 %) dan dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda. Perhitungan :

Jumlah Asam = b x c x 90 x 100% a

dengan : a = bobot/volume sampel, dinyatakan dalam ml b = volume larutan NaOH, dinyatakan dalam ml c = normalitas larutan NaOH

Penelitian Utama

Uji Aktivitas Antimikroba dari Yogurt Probiotik (Cintas et al., 1995)

Metode yang digunakan adalah metode difusi sumur (agar well diffusion method). Kultur bakteri uji dalam media TSB 5 ml berumur 24 jam diencerkan dengan standar Mcfarlane 0,5 (setara 1 x 108 cfu/ml) diencerkan dua kali sampai populasi 106 cfu/ml. Sebanyak 1 ml larutan pengencer yang telah diinokulasi bakteri uji diambil ke dalam cawan petri dan ditambahkan Mueller Hinton Agar yang telah

bersuhu 400C sebanyak 20 ml. Setelah agar dalam cawan mengeras, dibuat lubang menggunakan tabung durham steril berdiameter 5 mm. Sebanyak 50 μl yogurt probiotik disimpan ke dalam lubang sumur dan dibiarkan meresap ke dalam medium agar selama 30 menit pada suhu 70C (suhu refrigerator). Selanjutnya agar diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam, lalu zona penghambatan berupa areal bening disekeliling sumur yang dihasilkan diamati.

Diameter zona hambat diukur setiap 7 hari sekali. Diameter zona hambat diukur sebanyak tiga kali di tempat yang berbeda dan hasilnya dirata-ratakan. Cara pengukuran zona hambat ditampilkan pada Lampiran 7. Percobaan dilakukan dengan 3 ulangan. Analisis sensitivitas bakteri uji terhadap antimikroba yogurt probiotik juga dilakukan berdasarkan perbedaan Gram dan perbedaan spesies bakteri uji. Diagram alir uji aktivitas antimikroba yogurt probiotik ditampilkan pada Gambar 2.

Kultur bakteri uji berumur 24 jam dengan populasi 106cfu/ml

bakteri uji sebanyak 1 ml dimasukan ke dalam cawan

Mueller Hinton Agar bersuhu 400C ditambahkan 20 ml

dibuat lubang sumur berdiameter 5 mm

yogurt 50 µl disimpan ke dalam lubang sumur

dibiarkan meresap selama 30 menit pada 70C

inkubasi suhu 370C; 24 jam

HASIL DAN PEMBAHASAN