Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Ilmu Produksi Ternak Ruminansia Besar, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan selama lima bulan dari bulan Juli sampai Nopember 2008.
Materi
Bahan-bahan yang diperlukan untuk penelitian ini meliputi 28 isolat bakteri asam laktat asal daging sapi (1A1, 1A2, 1A32, 1A4, 1A5, 1A6, 1B1, 1B2, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 1D1, 1D2, 1D3, 2A1, 2A2, 2A3, 2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 2C2, 2C12, 2D1, 2D2, 2D41, 2D42) yang diperoleh dari penelitian sebelumnya oleh Arief et al. (2006). Kode ke-28 isolat ini diperoleh dari daging dengan masa penyimpanan berbeda yaitu 12 jam (1) dan 34 jam (2), pasar berbeda yaitu pasar Anyar 1 (A), pasar Cibeureum (B), pasar Ciampea (C), pasar Gunung Batu (D), pasar Anyar 2 (E) dan bakteri ke-1 (1), ke-2 (2), ke-3 (3), dst. Isolat 1A1, 1A4, 2B1, 2B3, 1D2, 2D1 dan 2D2 memiliki morfologi bentuk bulat sedangkan ke-21 isolat lainnya memiliki morfologi bentuk batang (Firmansyah, unpublished). Media yang digunakan adalah Buffer Pepton Water (BPW), Posphat Buffer Salin (PBS), de Man Rogosa Sharp Broth (MRSB), Bacteriological Agar (BA), Yeast Extract (YE), dan Ox gall. Bahan- bahan kimia yang digunakan adalah aquadestilata, buffer pH 4 dan 7, HCl 0,1N, NaOH 0,1N, alkohol 70%, dan teepol.
Peralatan yang diperlukan untuk penelitian ini adalah cawan Petri, pemanas Bunsen, pipet volumetrik (1 ml, 5 ml, dan 10 ml), mikropipet (0,1 ml, 1 ml dan 5 ml), tabung reaksi, vorteks, autoklaf, mikroskop, stopwatch, botol Schott, inkubator, alumunium foil, kompor, panci, gelas ukur, alat gelas lainnya dan alat-alat tulis.
Rancangan
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap pola searah sebanyak 28 isolat diuji pada pH dan garam empedu dengan tiga kali ulangan. Perlakuan yang diberikan meliputi kemampuan hidup isolat pada media berbeda yaitu dengan pH 2 dan pH 7,2 dengan kadar garam empedu 0,3%. Sidik ragam dilakukan untuk setiap parameter pengujian. Apabila hasil sidik ragam menunjukkan respon yang berbeda nyata, maka diuji lanjut dengan uji Jarak Berganda Duncan. Model matematika
16 rancangan percobaan yang digunakan mengacu pada Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut:
Yij = μ + τi + εij Keterangan:
Yijk. = Respon yang didapat (jumlah bakteri) dari pengaruh perlakuan.
µ = Nilai rataan umum
τi = Pengaruh perlakuan pH (2,0 dan 7,2) dan garam empedu 0,3%
Εij = Galat percobaan untuk taraf ke-i dan ulangan ke-j
Peubah yang diamati selama penelitian ini ialah jumlah populasi bakteri asam laktat yang mati dari masing-masing isolat kultur bakteri asam laktat untuk menentukan isolat yang mempunyai toleransi tertinggi terhadap kondisi lambung (pH 2,0) dan kondisi usus (pH 7,2) dengan kadar garam empedu 0,3% . Jumlah populasi bakteri asam laktat yang mati digunakan sebagai dasar penentu bakteri asam laktat sebagai kandidat probiotik.
Prosedur
Penelitian ini dilakukan melalui dua tahap yaitu (1) seleksi isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap lingkungan dengan kondisi yang berbeda yaitu pH 2 dan pH 7,2. Pada tahap 2 isolat bakteri asam laktat yang tahan terhadap pH 2 diseleksi kembali dalam media dengan garam empedu 0,3 % ox gall. Tahapan prosedur dapat dilihat pada Gambar 4.
Isolat bakteri asam laktat murni (hasil isolasi dari daging sapi)
17 Gambar 4. Tahapan Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Kandidat Probiotik Penyegaran dan Penghitungan Populasi Awal (Lin et al., 2006)
Penyegaran dilakukan setiap kali sebelum pengujian ketahanan bakteri terhadap asam maupun terhadap garam empedu. Penyegaran dilakukan dengan cara isolat induk bakteri asam laktat sebanyak 1% dari masing-masing 28 isolat bakteri asam laktat murni diinokulasikan ke dalam media MRS-broth 9 ml untuk kemudian di inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam untuk mendapatkan kultur kerja. Setelah diinkubasi dilakukan penghitungan populasi awal dengan cara sebelumnya diencerkan pada media BPW (10-7, 10-8,10-9), selanjutnya dipupukkan dalam media MRS-agar dengan metode pour plate.
Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging pada pH Lambung dan pH Usus (Lin et al., 2006)
Uji toleransi terhadap pH lambung dan pH usus dilakukan dengan cara 28 isolat kerja bakteri asam laktat diinokulasikan masing-masing sebanyak 1% dengan jumlah populasi awal minimal 108cfu/ml ke dalam media PBS untuk diatur pada pH 2,0 dan 7,2 menggunakan HCl 0,1N untuk menurunkan pH atau NaOH 0,1N untuk menaikkan pH. Selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 jam. Setelah
Penyegaran dalam media MRS-broth + yeast ekstrak
Uji ketahanan pada garam empedu (bile salt 0,3% dengan pH 7,2) selama 24 jam (UJI 2)
Uji ketahanan pada pH lambung (pH 2,0) selama 3 jam (Uji 1)
Seleksi isolat bakteri asam laktat yang mampu hidup pada uji 1 dan 2 (Jika didapatkan lebih dari 3 isolat, maka dipilih hanya 3 isolat dengan toleransi
pertumbuhan tertinggi, jika didapatkan ≤ 3 isolat, maka dipilih isolat tersebut) Uji ketahanan pada pH Usus (pH 7,2)
selama 3 jam (Uji 1)
Bakteri Asam Laktat yang mampu tumbuh pada pH 2,0 dan pH 7,2
18 itu dilakukan pemupukan untuk pnentuan jumlah populasi akhir dengan metode pour plate sesuai Fardiaz (1992). Pengenceran dilakukan pada media BPW (10-3, 10-4,10-5 untuk pH 2,0 dan 10-7, 10-8,10-9 untuk pH 7,2). Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37oC. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dengan setiap ulangan duplo. Penghitungan dilakukan terhadap koloni bakteri asam laktat yang terlihat berwana putih atau kekuningan dihitung sebagai populasi akhir. Toleransi bakteri asam laktat ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri asam laktat tersebut. Kematian bakteri asam laktat ditentukan dengan cara menghitung selisih antara populasi awal dikurangi populasi akhir. Diagram alir pengujian toleransi bakteri asam laktat terhadap pH lambung dan pH usus dapat dilihat pada Gambar 5.
pH 2,0 pH 7,2
HCl 0,1 N NaOH 0,1 N
Pengenceran tiga ulangan Pengenceran tiga ulangan
Pemupukan duplo Pemupukan duplo
Gambar 5. Diagram Alir Pengujian Toleransi Bakteri Asam Laktat terhadap pH 2,0 dan 7,2
Toleransi Isolat Bakteri Asam Laktat asal Daging terhadap Garam Empedu (Lin et al., 2006) PBS 9 ml pH 2,0 PBS 9 ml pH 2,0 PBS 9 ml pH 2,0
Inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam
Penghitungan Populasi Akhir Inkubasi selama 3 jam pada suhu 37 oC
Kultur Kerja Populasi awal ≥ 108cfu/ml
MRSA MRSA MRSA
BPW 10-4 BPW 10-5
BPW 10-3 BPW 10-7 BPW 10-8 BPW 10-9
MRSA MRSA MRSA
MRSA MRSA MRSA
MRSA MRSA MRSA
PBS 9 ml pH 7,2 PBS 9 ml pH 7,2 PBS 9 ml pH 7,2
19 Uji toleransi terhadap garam empedu dilakukan setelah didapat isolat bakteri asam laktat dari daging yang dapat tumbuh pada pH 2,0. Pengujian disesuaikan dengan kadar garam empedu pada saluran pencernaan yaitu dengan menggunakan ox gall sebanyak 0,3% b/v dalam media MRSB dengan pH 7,2. Pengujian dilakukan pada konsentrasi garam empedu 0,3% mengacu pada Marteu et al. (1997). MRS- broth basal ditambahkan garam empedu dengan konsentrasi 0,3% dengan pH 7,2, kemudian disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Sebanyak 1% kultur kerja isolat bakteri asam laktat dengan jumlah populasi awal minimal 108 cfu/ml diinokulasikan pada media MRSB yang telah ditambahkan garam empedu 0,3% steril lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diagram alir pengujian toleransi isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap garam empedu 0,3% dapat dilihat pada Gambar 6.
Ox gall 0,3%
Pengenceran tiga kali ulangan Pemupukan duplo
Gambar 6. Diagram Alir Pengujian Toleransi Bakteri Asam Laktat terhadap Garam Empedu 0,3%
Kultur Kerja Populasi awal ≥ 108 cfu/ml
Inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam
Penghitungan populasi Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC
MRSB 9 ml MRSB 9 ml
MRSB 9 ml
BPW 10-8 BPW 10-9 BPW 10-7
MRSA MRSA MRSA
20 Setelah diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, isolat diencerkan dengan media BPW untuk selanjutnya dipupukkan dalam media MRSA pada cawan petri dengan metode pour plate. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 48 jam, pengujian dilakukan sebanyak 3 kali. Populasi bakteri asam laktat yang dapat bertahan hidup diamati dengan cara menghitung jumlah koloni yang berwarna putih atau kekuningan sebagai populasi akhir. Toleransi bakteri asam laktat ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri asam laktat tersebut. Kematian bakteri asam laktat ditentukan dengan cara menghitung selisih antara populasi awal dikurangi populasi akhir.
