Penelitian ini dilakukan pada pertengahan bulan Desember 2010 sampai akhir bulan Februari 2011 di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Sampel Darah
Sampel darah kambing yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah dalam alkohol 96% (1:2) yang berjumlah 233 sampel dari koleksi sampel Laboratorium Genetika Molekuler Ternak pada tahun 2009 dan 2010 yang disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Sampel Darah Kambing
Bangsa Lokasi Jumlah (ekor)
PE Ciapus 20 Cariu 28 Sukajaya 50 Saanen Cijeruk 20 Cariu 31 Sukabumi 40 PESA Cariu 25 Balitnak 19 Total 233 Primer GH
Primer adalah molekul oligonukleotida yang berukuran pendek (sekitar 18-24 pasang basa) yang akan menempel pada DNA cetakan di tempat spesifik. Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen GH adalah primer forward: 5’ -TCT AGG ACA CAT CTC TGG GG-3’ dan primer reverse: 5’-CTC TCC CTA GGG CCC CGG AC-3’. DNA target yang akan di amplifikasi berada di daerah exon
17 (Malveiro et al., 2001). Sekuens gen GH exon 2 yang diapit oleh pasangan primer (Forward dan Reverse) ditunjukkan oleh Gambar 10.
Keterangan : cetak tebal bergaris bawah (posisi primer)
Gambar 10. Runutan Nukleotida Gen GH Exon 2 Berdasarkan GenBank No. D00476 (Kioka et al., 1989)
Formamida Dye
Komponen formamida dye terdiri dari 80% formamida solution,10 mM EDTA, 1 mg/ml bromthymol blue, dan 1 mg/ml xylene cyanol.
Gel Agarose 1,5%
Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat 1 lembar gel agarose 1,5% adalah larutan 0,5 x TBE (Tris-Borat EDTA) 30 ml, serbuk agarose 0,45 gram, dan 2,5 μl EtBr.
Gel Poliakrilamida 12%
Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat 1 lembar gel poliakrilamid 12% adalah air destilata steril 12,3 ml, larutan 30% akrilamida (akrilamida : bis = 29: 1) 10 ml, 2,5 ml larutan 5 x TBE, TEMED 15 μl, dan 10% APS 150μl.
Pewarnaan Perak (Silver Staining)
Bahan-bahan yang digunakan dalam pewarnaan perak adalah larutan A, air destilata (200 ml), larutan B, dan larutan C. Larutan A terdiri dari 200 ml air destilata, 0,2 gram AgNO3, 80 μl NaOH, dan 800 μl ammonia. Larutan B terdiri dari 200 ml air
destilata, 6 gram NaOH dan 200 μl formaldehid, sementara larutan C terdiri dari 100 ml air destilata dan 100 μl asam asetat.
Ekstraksi DNA
Bahan-bahan yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah TE (Tris EDTA), STE (Sodium Tris-EDTA), NaCl, SDS, CIAA (chloroform iso amil alkohol), dan etanol.
661 ctccgtcgcg gccctcctgg tCTCTCCCTA GGGCCCCGGA Cgtccctgct cctggctttc 721 accctgctct gcctgccctg gactcaggtg gtgggcgcct tcccagccat gtccttgtcc 781 ggcctgtttg ccaacgctgt gctccgggct cagcacctgc atcaactggc tgctgacacc 841 ttcaaagagt ttgtaagctC CCCAGAGATG TGTCCTAGAg gtggggaggc aggaaggggt
18
Prosedur Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan secara konvensional mengikuti metode Sambrook
et al. (1989). Sampel darah dalam EtOH diambil sebanyak 200 μl dan dipindahkan kedalam tabung 1,5 ml, ditambahkan 1000 ml air destilata kemudian di homogenkan dan diamkan selama ± 5 menit. Campuran tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit dan bagian supernatannya dibuang. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan air destilata sebanyak dua kali. Tahap selanjutnya adalah penambahan 40 μl SDS 10%, 10 μl Prot K 5 mg/ml dan 1 x STE sampai volumenya 400 μl, dikocok pelan dalam inkubator pada suhu 550
C selama 2 jam. Molekul DNA dimurnikan dengan cara penambahkan larutan fenol sebanyak 400 μl, 400 μl CIAA, dan 40 μl 5M NaCl yang dikocok pelan pada suhu ruang selama 1 jam. Molekul DNA yang larut dalam fase air dipisahkan dari fase fenol dengan alat sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Bagian DNA (bening) dipindahkan dengan menggunakan pipet ke tabung 1,5 ml baru dan ditambahkan 800 μl EtOH absolut serta 40 μl 5M NaCl, kemudian dibekukanselama satu malam. Molekul DNA kemudian dipisahkan dari EtOH absolut dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan yang dihasilkan dicuci dengan menambahkan EtOH 70% sebanyak 800 μl. Molekul DNA dipisahkan dari EtOH 70% dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dibuang sehingga diperoleh endapan molekul DNA. Endapan tersebut didiamkan dalam keadaan terbuka sampai alkohol hilang dan disuspensikan dalam 100 μl TE 80% buffer TE (tris-EDTA) dan disimpan dalam freezer sampai akan digunakan.
Amplifikasi Gen GH
Amplifikasi gen GH secara in vitro menggunakan teknik PCR dengan mesin
thermocycler. Pereaksi PCR terdiri dari sampel DNA 1 μl, air destilata 8,9 μl, primer 0,2 μl, 10 x buffer 1,2 μl, dNTP 0,1 μl, MgCl2 0,5 μl, dan enzim Taq fermentas 0,1 μl dengan volume akhir 12 μl . Campuran tersebut kemudian diinkubasikan dalam mesin thermocycler dengan kondisi sebagai berikut: tahap pradenaturasi pada suhu
19 95 oC selama 5 menit, tahap kedua yang terdiri dari 35 siklus yang masing-masing siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 95 oC selama 30 detik, penempelan (annealing) 63 oC selama 45 detik, ekstensi awal molekul DNA 72 oC selama 1 menit, dan tahap terakhir adalah ekstensi akhir 72 oC selama 5 menit.
Pendektesiaan Keragaman Gen GH dengan Metode PCR-SSCP
Elektroforesis dilakukan pada produk PCR yang telah dihasilkan dengan menggunakan gel agarose 1,5% dengan tegangan 150 volt. Produk PCR sebanyak 5 μl dicampur dengan loading dye (bromthymol blue 0,01%, xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%) 0,5 μl dimasukkan pada masing-masing sisir yang terdapat pada gel agarose 1,5%, kemudian ditambahkan dengan marker 100 pb. Setelah elektroforesis, (± 35 menit) gel agarose diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan menggunakan UV-Transilluminator. Produk PCR yang tersisa (7 μl) kemudian ditambahkan formamide dye sebanyak 7 μl. Campuran tersebut diinkubasi dalam
water bath pada suhu 94 oC selama 5 menit dengan tujuan membuat fragmen DNA untai ganda menjadi untai tunggal. Setelah itu, tabung yang berisi campuran tersebut segera didinginkan pada suhu 0 oC selama 5 menit. Larutan formamida dye berfungsi untuk mencegah penempelan kembali antara DNA untai tunggal. Sampel sebanyak 10 μl didistribusikan dalam gel 12% poliakrilamida nondenaturasi untuk mendeteksi keragaman bentuk DNA untai tunggal. Alat elektroforesis dijalankan pada tegangan 370 V selama 18 jam di dalam refrigerator. Setelah itu, gel 12% poliakrilamida dikeluarkan dari cetakan dan dilakukan pewarnaan perak.
Pewarnaan Perak
Gel dikeluarkan dari cetakannya setelah elektroforesis selesai dan direndam dalam larutan A selama 8 menit. Setelah itu, larutan A dibuang dan gel dibilas dengan air destilata. Perendaman selanjutnya adalah menggunakan larutan B sambil digoyang sampai muncul pita. Larutan B dibuang setelah muncul pita, kemudian gel direndam dalam larutan asam asetat (larutan C) untuk menghentikan reduksi perak.
Penentuan Genotipe Gen GH
Keragaman gen GH dapat dideteksi dengan membandingkan banyaknya pita yang muncul dalam gel 12% poliakrilamida nondenaturasi. Penentuan tipe gen GH dalam penelitian ini adalah didasarkan pada perbedaan banyaknya pita yang muncul
20 disebabkan karena perbedaan konformasi fragmen DNA untai tunggal. Konformasi yang berbeda akan mempengaruhi laju migrasi gel 12% poliakrilamida nondenaturasi sehingga dapat diidentifikasikan keragamannya. Penentuan genotipe sampel mengacu pada Malveiro et al. (2001) (Gambar 11) namun berbeda dalam cara penamaannya, dalam penelitian ini didasarkan pada migrasi dari anoda (-) ke katoda (+), sehingga pita DNA yang lebih dahulu bermigrasi dinamakan A.
Gambar 11. Hasil Visualisasi Pita Gen GH Exon 2 pada Kambing Algarvia dengan Metode PCR-SSCP (Malviero etal., 2001)
Analisis Data Frekuensi Alel dan Genotipe
Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari migrasi pita-pita DNA. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran yang sama dan dihitung frekuensi alelnya (Nei dan Kumar, 2000) :
Keterangan :
Xi = frekuensi alel ke-i Xii = frekuensi genotipe ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N = jumlah total sampel
Frekuensi genotipe dihitung dengan persamaan sebagai berikut (Walpole, 1995) :
21
Derajat Heterozigositas
Keragaman genetik (genetic variability) dilakukan melalui perhitungan nilai heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He) (Weir, 1996) :
Keterangan :
Ho = frekuensi heterozigositas pengamatan
N1ij = jumlah individu heterozigositas pada lokus ke-1 N = jumlah individu yang dianalisis
Keterangan :
He = frekuensi heterozigositas harapan P1i = frekuensi alel ke-1 pada lokus 1 n = jumlah alel pada lokus ke-1
22
HASIL DAN PEMBAHASAN