Penelitian ini dilaksanakan di bagian IPT Ruminansia Besar Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas Peternakan, dan Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Antar Universitas (PAU) pada bulan Oktober sampai November 2008.
Materi
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi segar bagian gandik (paha belakang) yang diperoleh dari Unit Pemotongan Ternak Daging
(UPTD) Kota Bogor. Kultur yang digunakan adalah Lactobacillus plantarum 1A5
yang telah dilakukan API TEST (Arief, 2009 unpublished). Media yang digunakan
dalam pengujian mikroorganisme pada daging segar adalah deMan ragosa sharp
broth (MRSB), buffer peptone water (BPW), plate count agar (PCA), eosyin methylen blue agar (EMBA), vogel johnson agar (VJA), kalium telurit 1%, yeast ekstrak (YE) 3 % dan aquadest steril.
Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet 10 ml, mikro pipet 1 ml, tik, tabung reaksi, pH meter, autoclave, bunsen, alumunium foil, oven, tabung ependorf, kantong plastik HDPE tahan panas, inkubator, kapas, tabung scott, alat sentrifugasi
Hettich Zentrifugen 6000 rpm, water press, planimeter, serta refrigerator.
Rancangan
Penelitian ini menggunakan metode rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dengan tiga kali ulangan. RAL pola faktorial terdiri dari 2 perlakuan yang terdiri dari perlakuan pertama adalah perbandingan bakso yang diberi perlakuan
antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5 dengan bakso kontrol dan faktor
kedua yaitu lama penyimpanan pada 0, 5 dan 10 hari. Menurut Steel dan Torrie (1995) model matematika yang digunakan adalah
Yijk = µ + i + j + ( ) ij + ε ijk Keterangan:
Yijk = respon pengaruh lama penyimpanan terhadap penambahan substrat
antimikroba
µ = nilai tengah populasi
14
βj = pengaruh lama penyimpanan ke-k (faktor 2)
(αβ) ij = pengaruh interaksi faktor 1 dan 2
εijk = galat percobaan pengaruh perlakuan pertama ke-i dan ulangan ke-k
i = lama penyimpanan (0,5 dan10 hari)
k = ulangan (1, 2 dan 3)
Analisis Data
Data yang dihasilkan pada penelitian ini dianalisis dengan menggunakan General Linier Model (GLM) pada program minitab 14. Jika data yang dihasilkan berbeda nyata P<0,05 maka dilakukan uji Tukey untuk membandingkan bakso kontrol dengan bakso yang direndam antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5 dengan menggunakan program minitab 14.
Prosedur
Tahapan kerja penelitian ini terdiri atas penyegaran bakteri asam laktat,
produksi antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5, pembuatan bakso,
pengawetan bakso dengan antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5.
Penyegaran Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan substrat antimikroba yang memiliki daya penghambatan satu terhadap bakteri patogen terbaik yaitu
Lactobacillus plantarum berdasarkan hasil penelitian Permanasari (2008) dengan kode isolat IA5 sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam 9 ml MRSB yang diperkaya YE 3%, dihomogenisasi dan diinkubasi selama 24 jam.
Produksi Antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5
Bakteri asam laktat yang sudah disegarkan dihomogenisasi kemudian diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml MRSB yang diperkaya YE, dihomogenisasi dan diinkubasi selama 20 jam. Setelah 20 jam, bakteri asam laktat
Lactobacillus plantarum 1A5 dimasukkan ke dalam tabung ependorf, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Setelah itu, supernatan (bagian atas yang terpisah, hasil dari sentrifugasi) tersebut disaring dengan penyaring millipore 0,22 µm ke dalam wadah tabung scott steril. Antimikroba yang sudah disaring dinamakan supernatan bebas sel (SBS).
15
Pembuatan Bakso
Daging segar 400 gram dipotong-potong kemudian digiling dalam food
proccessor bersama garam 3,2%, STPP 0,5%, dan ½ bagian es batu. Bumbu-bumbu seperti merica dan bawang putih 1%, tepung tapioka 2%, dan sisa ½ bagian es ditambahkan ke dalam adonan. Adonan kembali digiling sampai tercampur rata dan adonan menjadi legit. Adonan tersebut lalu dibentuk bulat-bulat dan dimasukkan ke dalam air hangat. Setelah mulai mengambang, bakso direbus sampai matang (kira- kira 10-15 menit). Sebagian bakso diambil sebagai kontrol dan sebagian dikenakan perlakuan pengawetan dengan antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5. Pengawetan Bakso dengan Antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5
Bakso dimasukkan ke dalam plastik tahan panas yang telah disterilkan sebelumnya lalu ditambahkan antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5 yang telah didapat dari hasil ekstraksi dengan perbandingan bakso dan penambahan antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5 adalah 1: 1. Kemudian plastik ditutup dan dibiarkan selama 30 menit. Bakso dipisahkan untuk masing-masing disimpan selama 0, 5 dan 10 hari dengan 3 ulangan untuk dilakukan analisis kuantitatif bakteri (E. coli, staphylococcus aureus, dan TPC) dan analisis pendugaan bakteri Salmonella
spp. Prosedur pembuatan bakso dengan penambahan antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5 dapat dilihat pada Gambar 3.
16 Bakso kontrol
Penyimpanan pada refrigerator dengan suhu 4-7°C Dipotong-potong Penggilingan dengan food processor Garam, STPP, ½ es batu Adonan
Merica, bawang putih, tepung tapioka, dan sisa ½ bagian es Penggilingan kembali
Pembentukan
Bakso matang
Bakso direndam antimikroba IA5 dengan
perbandingan 1:1
Pengamatan pada 0, 5 dan 10 hari
Daging sapi
Gambar 3. Alur Proses Pembuatan Bakso dengan Penambahan Antimikroba dari Lactobacillus plantarum 1A5
17
Analisis Mikrobiologi
Nilai pH (AOAC, 1995). Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter Hanna. Caranya adalah pH meter dikalibrasi dengan larutan standar (ber-pH 4 dan 7), kemudian sampel bakso sebanyak 5 gram dihancurkan dan dilarutkan ke dalam 45 ml akuades lalu elektroda pH meter dimasukan ke dalam larutan bakso dan dilihat nilai pHnya.
Analisis Kuantitatif Total Plate Count (TPC) (APHA, 1992). Pengukuran TPC dilakukan dengan cara 10 g bakso dimasukkan bersama larutan pengencer (BPW) sebanyak 90 ml dihancurkan sampai menjadi homogen sebagai pengenceran pertama. Sebanyak 1 ml dari larutan pengencer pertama yang sudah homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer sehingga terbentuk pengenceran 10-2 kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. Pengenceran ini dilakukan sampai pengenceran 10-7. Setelah pengenceran, dilakukan pemupukan dengan cara mengambil sebanyak 1 ml pengencer dari masing-masing tabung pengenceran (berdasarkan 3 pengenceran terakhir yaitu 10-5, 10-6, dan 10-7) dipindahkan ke dalam cawan petri steril secara duplo. Media agar Plate Count Agar
(PCA) ditambahkan ke dalam cawan Petri tersebut. Pemupukan dilakukan dengan metode tuang sebanyak ±20 ml dan dihomogenkan membentuk angka 8. Cawan petri (agar yang sudah membeku) diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 370C selama 24 jam.
Analisis Kuantitatif Staphylococcus aureus (Fardiaz, 1993).Pengukuran S. aureus
dilakukan dengan cara bakso 10 g dimasukkan ke dalam plastik steril yang telah berisi larutan pengencer (BPW) sebanyak 90 ml kemudian dihancurkan sampai larutan menjadi homogen sebagai pengenceran pertama. Sebanyak 1 ml dari larutan pengencer pertama yang sudah homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer sehingga terbentuk pengenceran 10-2 kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. Pengenceran dilakukan sampai 10-5. Setelah pengenceran, dilakukan pemupukan dengan cara mengambil sebanyak 1 ml pengencer dari masing-masing tabung pengenceran (berdasarkan 3 pengenceran terakhir yaitu 10-3, 10-4, dan 10-5) dipindahkan ke dalam cawan Petri steril secara duplo. Media agar
18 dalam cawan petri tersebut. Pemupukan ini dilakukan dengan metode tuang sebanyak ±20 ml dan dihomogenkan membentuk angka 8. Cawan petri (agar yang sudah membeku) diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37°C selama 24 jam. Koloni S. aureus berwarna hitam dikelilingi kuning.
Analisis Kuantitatif Escherichia coli (APHA, 1992).Pengukuran E. coli dilakukan cara 10 g bakso dimasukkan ke dalam plastik yang telah steril berisi larutan pengencer (BPW) sebanyak 90 ml. Kemudian bakso dihancurkan sampai larutan menjadi homogen sebagai pengenceran pertama. Sebanyak 1 ml dari larutan pengencer pertama yang sudah homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer sehingga terbentuk pengenceran 10-2 kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. pengenceran dilakukan sampai 10-5. Setelah pengenceran, dilakukan pemupukan dengan cara mengambil sebanyak 1 ml pengencer dari masing-masing tabung pengenceran (berdasarkan 3 pengenceran terakhir yaitu 10-3, 10-4, dan 10-5) dipindahkan ke dalam cawan petri steril secara duplo. Media agar
eosyn methylen blue agar (EMBA) ditambahkan ke dalam cawan petri tersebut. Pemupukan ini dilakukan dengan metode tuang sebanyak ±20 ml dan dihomogenkan membentuk angka 8. Cawan petri (agar yang sudah membeku) diinkubasi dengan
posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37°C selama 24 jam. Koloni E. coli
berwarna kehijauan jika diletakkan di bawah sinar matahari atau sinar lampu.
Analisis Konfirmasi Salmonella spp (BAM, 2007)
Prinsip analisis Salmonella spp adalah dengan menumbuhkannya pada media
selektif dengan pra pengayaan (pre enrichment), dan pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan isolasi dan identifikasi.
Pra-pengayaan. Sampel ditimbang sebanyak 25 gram atau ukur sebanyak 25 ml sampel secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam wadah steril. 225 ml larutan LB (Lactose Broth) ke dalam kantong steril yang berisi sampel, dihomogenkan dengan stomacher selama 1 menit sampai dengan 2 menit. Suspensi dipindahkan ke dalam labu erlemeyer atau wadah steril. Diinkubasikan pada temperatur 35°C selama 24 jam±2 jam.
Pengayaan. Biakan pra-pengayaan diaduk perlahan kemudian diambil dan dipindahkan berturut-turut ke dalam media 10 ml SCB kemudian diinkubasi pada temperatur 35°C selama 24 jam.
20
Isolasi dan identifikasi. Suspensi diambil dengan jarum ose dari masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasikan dan diinokulasikan pada media BSA. Diinkubasikan pada temperatur 35°C selama 24 jam±2 jam. Kemudian koloni diamati, pada media BSA koloni Salmonella terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam. Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga sebagai Salmonella dari ketiga media tersebut dan diinokulasikan koloni ke TSIA dan LIA dengan cara menusuk ke dalam bagian tegak agar miring, selanjutnya digores pada permukaan agar miring. Diinkubasikan pada temperatur
35°C selama 24 jam±2 jam. Koloni spesifik Salmonella diamati dengan merujuk
pada hasil reaksi seperti tercantum pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Uji Salmonella spp pada Media Agar TSIA dan LIA
Media Agar Miring Dasar Agar H2S Gas
TSIA Alkalin/K Asam/A Positif Negatif
(merah) (kuning) (hitam) positif
LIA Alkalin/K Alkalin/K Positif Negatif
(ungu) (ungu) (hitam) positif
Keterangan: LB : Lactose Broth SCB : Selenite Cystine Broth TSIA : Triple Sugar Iron Agar LIA : Lysine Iron Agar BSA : Bismut Sulfit Agar
