Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor sejak bulan September 2006 sampai Desember 2006.
Bahan
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Pseudomonas fluorescens PG01, Bacillus polymixa BG25 yang merupakan koleksi Klinik Tanaman Departemen Proteksi Tanaman. Bahan tanaman uji yang digunakan adalah cabai besar (Capsicum annuum) varietas TIT Super LV yang didapat di toko pertanian. Sumber inokulum berasal dari koleksi Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, yaitu tanaman tembakau yang terinfeksi Tobacco mosaic virus (TMV).
Metode Pembuatan Suspensi Bakteri
Biakan murni bakteri yang berasal dari koleksi Klinik Tanaman diambil sebanyak 1 sampai 3 loop dari stok awal dan digoreskan pada media untuk diremajakan. Bakteri kelompok Pseudomonas sp. dibiakkan pada media King’s B dan bakteri kelompok Bacillus sp. dibiakkan pada media Tryctic Soy Agar (TSA). Bakteri yang telah diremajakan diinkubasikan pada suhu ruangan selama 48 jam. Sebanyak 15 loop biakan murni yang didapat diencerkan dalam 100 ml NaCl 0,85% sehingga didapat suspensi bakteri (stok) dengan kepadatan masing-masing kira-kira 1012 cfu/ml untuk Bacillus dan 1013 cfu/ml untuk Pseudomonas (Jamaliah 2005).
Perlakuan Benih, Penanaman dan penyiraman bakteri Tanaman Uji
Masing-masing suspensi stok bakteri diencerkan secara bertingkat sehingga didapat suspensi dengan kepadatan 109 cfu dalam 15 ml NaCl 0,85%.
Sebanyak 5 ml dari masing-masing suspensi bakteri dicampurkan sehingga didapat suspensi kombinasi kedua bakteri tersebut (campuran) dengan kepadatan yang sama. Benih cabai yang sebelumnya telah dicuci kemudian dimasukkan ke dalam suspensi bakteri (PG01, BG25, dan campuran) dan dibiarkan selama 10 jam pada suhu ruang. Sebagai kontrol, benih cabai direndam dalam 10 ml NaCl 0,85% selama 10 jam.
Benih yang telah direndam disebar pada baki semai yang berisi media tanam berupa campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:2 (v/v). setelah berumur dua minggu setelah sebar dilakukan pemindahan tanaman ke dalam polybag dengan media yang sama pada pesemaian.
Satu minggu setelah tanaman berada di dalam polibag, dilakukan penyiraman suspensi bakteri dengan kepadatan 1011 cfu sebanyak 2 ml per polibag. Penyiraman dilakukan kembali satu minggu kemudian. Pemupukan dilakukan pada saat tanaman berumur lima minggu dengan pupuk majemuk NPK dengan dosis 5 g/polibag.
Inokulasi Virus pada Tanaman Uji
Inokulasi TMV secara mekanis dilakukan pada tanaman cabai yang telah berumur enam minggu. Daun tembakau yang terinfeksi TMV yang digunakan sebagai sumber inokulum diambil secukupnya dan ditimbang, kemudian digerus dalam mortar dengan diberi bufer fosfat dengan perbandingan berat basah daun : buffer fosfat 1:200 (b/v). Dari hasil penggerusan ini didapat sap sebagai inokulum virus yang siap dioleskan ke tanaman cabai. Daun tanaman cabai yang akan diinokulasi sebelumnya ditaburi serbuk Carborumdum untuk menimbulkan luka pada jaringan tanaman. Setelah diinokulasi tanaman dipelihara sampai muncul gejala.
Pengamatan Pertumbuhan dan Produksi Tanaman
Variabel pengamatan terkait pertumbuhan, yaitu: tinggi tanaman, panjang daun, lebar daun, dan jumlah bunga yang diukur pada 8 minggu setelah tanam (MST). Sedangkan variabel terkait produksi tanaman, yaitu bobot buah/tanaman dan jumlah buah/tanaman yang dihitung pada 13 MST.
Pengamatan Masa Inkubasi, Kejadian Penyakit, dan Keparahan Penyakit Pengamatan masa inkubasi dimulai sejak tanaman cabai diinokulasi TMV sampai dengan gejala pertama muncul.
Pengukuran kejadian penyakit yang terjadi pada tanaman uji dihitung pada 4 minggu setelah inokulasi TMV (MSI TMV).
Penghitungan kejadian penyakit menggunakan rumus: KP = n/N x 100%
Keterangan :
KP = Kejadian penyakit (%)
N = jumlah tanaman yang terinfeksi virus N = jumlah seluruh tanaman
Pengamatan keparahan penyakit diukur pada 4 MSI TMV dengan mengukur seluruh bagian tanaman atas (tajuk tanaman) pada masing-masing tanaman uji. Kategori skor yang digunakan yaitu:
0 : tidak bergejala
2 : mosaik ringan pada daun 4 : mosaik berat pada daun
6 : perubahan bentuk daun dan mosaik 8 : mosaik parah dan perubahan bentuk daun
10 : mosaik parah dan deformasi daun disertai tanaman kerdil
Nilai skor yang didapat kemudian dikonversi dalam nilai keparahan penyakit (disease severity) berdasarkan rumus Townsend & Heuberger (1974 dalam Agrios 1997):
KP = [Σ nivi/NV] x 100% Keterangan:
KP = keparahan penyakit
ni = jumlah tanaman dengan skor ke-i vi = nilai skor penyakit
N = jumlah tanaman yang diamati V = skor tertinggi
Deteksi Virus dengan Metode ELISA
Deteksi TMV dilakukan dengan metode direct ELISA. Antibodi TMV (Agdia, USA) yang diencerkan 1:1000 dalam coating bufer (Sodium carbonate 1,59 g, Sodium bicarbonate 2,93 g, Sodium azide 0,2 g) dimasukkan ke dalam sumuran plate sebanyak 100 l dan diinkubasikan pada 4ο C salama semalam, keesokan harinya sumuran plate dibilas 4-8 kali dengan bufer PBST (Sodium chloride 8 g, Sodium phosphate 1,15 g, Potassium phosphate 0,2 g, Potassium chloride 0,2 g, tween-20 0,5 g). Daun sebanyak 0,05 g digerus bersama dengan 500 l bufer GEB (Sodium sulfite 1,3 g, Polyvinylpyrrolidone 20 g, Sodium azide 0,2 g, Powdered egg chicken albumin 2 g, tween-20 20 g). Sap tanaman yang dihasilkan diambil sebanyak 100 l, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran plate, selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang selama 2 jam. Kemudian sap dibuang dan sumuran plate dibilas 4-8 kali dengan bufer PBST. Enzim konjugat (Agdia, USA) yang diencerkan 1:1000 dalam bufer ECI (Bovine serum albumin 2 g, Polyvinylpyrrolidone 20 g, Sodium azide 0,2 g) dimasukkan ke dalam sumuran plate sebanyak 100 l dan diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang, kemudian dibilas kembali dengan PBST 4-8 kali.
Deteksi hasil uji ini menggunakan p-nitrophenyl phosphate/PNP yang dilarutkan dalam bufer PNP (Magnesium chloride 0,1 g, Sodium azide 0,2 g, Diethanolamine 97 ml) sebanyak 100 l yang dimasukkan ke dalam sumuran plate dan diinkubasikan selama 30-60 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 l Natrium hidroksida 3 M. Perubahan warna cairan dalam sumuran yang menjadi kuning menunjukkan reaksi positif. Analisis secara kuantitatif dilakukan dengan mengukur nilai absorban dengan ELISA plate reader. Reaksi dinyatakan positif terinfeksi TMV apabila nilai absorban ( 405 nm) tanaman uji lebih tinggi dari nilai absorbansi rata-rata tanaman kontrol ditambah dua kali nilai standar deviasinya.
Rancangan Percobaan
Percobaan disusun dalam rancangan acak lengkap. Unit perlakuan terdiri dari 8 perlakuan, yaitu : PG01, BG25, campuran, kontrol (tanpa perlakuan rizobakteri), PG01 yang diinokulasi TMV (PG01+TMV), BG25+TMV,
campuran+TMV, kontrol (tanpa perlakuan rizobakteri) +TMV. Setiap perlakuan terdiri dari 4 ulangan dan masing-masing ulangan terdiri dari 3 tanaman.
Analisis Data
Data variabel pengamatan yang didapat dianalisis dengan menggunakan program SAS for Windows v 6.12 melalui Analisys of Variance (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf nyata 5% (ά = 0,05).