Waktu dan Tempat
Penelitian berlangsung dari bulan Agustus 2006 sampai dengan Juli 2007. Sampel terumbu karang berasal dari perairan di sekitar Pulau Jukung, Kepulauan Seribu. Isolasi bakteri, uji in vitro dan uji in vivo dilaksanakan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Tahap sekuensing untuk identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium Bioteknologi PUSPIPTEK Serpong.
Media, Antibiotik dan Bahan Kimia
Media yang digunakan untuk mengisolasi bakteri adalah SWC-agar (Sea Water Complete agar) (Lampiran 1). Selain itu digunakan juga media selektif TCBS-agar (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose agar) untuk menumbuhkan Vibrio sp. (Lampiran 1).
Antibiotik yang digunakan adalah Rifampisin. Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi DNA terdiri dari : 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0 dan 1 mM EDTA pH 8.0), lysozyme 50 mg/ml (50 mg lysozyme, 30 µl NaCl 5M, 200 µl EDTA 0.5 M, 770 µl ddH2O), 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 10 mg/ml Proteinase-K, 5 M NaCl, 10% CTAB/NaCl, phenol:chloroform: isoamylalcohol (25:24:1,v/v), chloroform:isoamylalcohol (24:1, v/v), isopropanol absolute, 70% ethanol dan aquabidest steril. Proses elektroforesis menggunakan bahan kimia sebagai berikut : 1% agarose, 1X TBE buffer dan loading dye (0.25% Bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol, 50% glycerol, 6 mM EDTA pH 8).
Amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan bahan-bahan sebagai berikut : aquabidest steril 15.1 µl, primer 63f 1 µl, primer 1387r µl, dNTP 2.5 µl, Taq DNA polymerase 0.4 µl, polymerase buffer 2.5 µl, MgCl2 2.0 µl dan template DNA 0.5 µl. Untuk gene clean digunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit Geneaid.
Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik dari Terumbu Karang
Sampel terumbu karang dikemas dalam kantong plastik steril yang telah diberi air laut dan oksigen. Kantong plastik disusun di dalam wadah stereofoam dan diberi potongan es disekitarnya. Sebelum diisolasi bakterinya, sampel
ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dibilas dengan air laut steril sebanyak 1-2 kali untuk mencegah kontaminan. Sampel selanjutnya dihaluskan dan disebar sebanyak 100 µl pada media Sea Water Complete agar (SWC-agar) lalu diinkubasi pada suhu ruang (28-310C) selama 24 jam. Koloni yang tumbuh kemudian digunakan dalam uji in vitro.
Uji in vitroBakteri Kandidat Probiotik a. Metode Zona Hambat
Isolat V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik berumur 24 jam diencerkan hingga memiliki tingkat kekeruhan yang sama dengan konsentrasi biakan dalam suspensi sekitar 109 sel/ml. Selanjutnya V. harveyi MR5339 RfR disebar pada media SWC-agar sebanyak 50µl. Kertas cakram (Whatman antibiotic assay paper) berdiameter 6 mm ditetesi suspensi bakteri kandidat probiotik sebanyak 10 µl, kemudian ditaruh di atas media SWC-agar yang telah diberi V. harveyi MR5339 RfR. Sebagai kontrol digunakan larutan garam fisiologis. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang, diameter zona bening yang dihasilkan diukur menggunakan penggaris pada 3 posisi dari setiap kertas cakram, kemudian dirata-ratakan.
b. Metode Kultur Bersama
Isolat-isolat yang tidak menghasilkan zona hambat diuji kemampuannya melawan V. harveyi MR5339 RfR dengan metode kultur bersama. Isolat–isolat tersebut ditumbuhkan pada media SWC-cair dengan kepadatan 102 CFU/ml. Pada tabung yang sama ditambahkan 102 CFU/ml V. harveyi MR5339 RfR kemudian diinkubasi semalam pada inkubator bergoyang dengan suhu 280C. Kultur selanjutnya disebar pada media SWC+Rf sehingga hanya V. harveyi MR5339 RfR yang tumbuh. Apabila V. harveyi MR5339 RfR pada tabung kontrol (tanpa isolat bakteri kandidat probiotik) tumbuh jauh lebih banyak dibandingkan dengan kultur campuran (V. harveyi MR5339 RfR dicampur dengan isolat bakteri kandidat probiotik), berarti bakteri kandidat probiotik mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR.
Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik
Sebelum dilakukan uji in vivo pada udang, sepuluh isolat masing-masing lima isolat dari metode zona hambat dan lima isolat dari metode kultur bersama
14
diuji patogenisitasnya pada udang. Satu lup dari masing-masing isolat ditumbuhkan dalam media SWC-cair secara terpisah. Kultur ditempatkan pada inkubator bergoyang selama 10 jam pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu ruang. Pellet sel yang terbentuk kemudian diresuspensikan dalam larutan fisiologis dan ditambahkan pada media pemeliharaan larva udang hingga mencapai konsentrasi akhir 106 CFU/ml. Larva udang dipelihara dalam toples yang diisi air laut steril 2 liter dengan kepadatan 10 ekor/l dan diberi pakan Artemia 3-5 individu/ml. Patogenisitas bakteri kandidat probiotik diamati melalui kematian larva selama 5 hari pemeliharaan. Pada akhir percobaan dihitung kelangsungan hidup (SR) larva udang dan dibandingkan dengan kontrol, yakni perlakuan tanpa penambahan bakteri kandidat probiotik. Pembuatan Mutan Bakteri Kandidat Probiotik
Isolat-isolat yang menghasilkan kelangsungan hidup terbaik pada uji patogenisitas, sebelum uji in vivo pada larva udang diberi penanda resisten rifampisin (RfR) terlebih dahulu. Pemberian penanda RfR pada bakteri kandidat probiotik dilakukan melalui mutasi spontan dengan menumbuhkan bakteri tersebut pada media SWC-agar yang telah mengandung rifampisin 50 µg/ml (SWC+Rf). Pemberian penanda RfR pada bakteri probiotik dimaksudkan agar keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dan lingkungan pemeliharaannya dapat dimonitor.
Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik
Isolat-isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial dan tidak bersifat patogen diuji efektifitasnya dalam menghambat serangan V. harveyi MR5339 RfR pada larva udang. Isolat bakteri kandidat probiotik diinokulasikan ke dalam wadah pemeliharaan udang hingga mencapai konsentrasi akhir 106 CFU/ml sehari setelah larva udang dimasukkan. Setelah kokultivasi dengan larva udang selama 6 jam, V. harveyi MR5339 RfR diinokulasikan ke dalam wadah pemeliharaan udang hingga mencapai konsentrasi akhir 106 CFU/ml. Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol (kontrol positif : hanya diinokulasi V. harveyi MR5339 RfR, kontrol negatif : tanpa penambahan V. harveyi MR5339 RfR maupun bakteri kandidat probiotik). Pengamatan dilakukan selama 12 hari dan pada akhir percobaan dihitung SR larva udang, populasi
bakteri baik dari larva udang maupun dari media airnya setiap tiga hari. Selama percobaan larva udang diberi pakan Artemia sebanyak 3-5 individu/ml.
Identifikasi Bakteri Probiotik Terpilih
Identifikasi isolat terpilih dilakukan berdasarkan hasil sekuensing gen 16S r RNA (Marchesi et al., 1998). Sekuensing gen 16S-rRNA terdiri dari tahapan ekstraksi DNA, amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR (Suwanto, 2002), gene clean menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction KIT Geneaid dan sekuensing dengan mesin Sequenser.
a. Ekstraksi DNA
Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan dalam media SWC-cair. Kultur diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 28-290C, 130 rpm selama 24 jam. Sel bakteri dipanen dengan mengambil 1.5 ml suspensi biakan bakteri lalu dimasukkan ke dalam eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 2 menit. Selanjutnya supernatan dibuang. Tahap ini diulang sebanyak tiga kali. Pellet bakteri yang terbentuk diresuspensi dengan 1 ml buffer TE 1X dan disentrifugasi 6000 rpm 2 menit. Setelah disentrifugasi, supernatan yang ada dibuang.
Pellet yang tertinggal diresuspensi dengan 500 µl buffer TE 1X, selanjutnya ditambahkan 100 µl lysozyme 50 mg/ml lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 0C. Setelah diinkubasi ditambahkan 100 µl SDS 10% dan 10 µl proteinase-K lalu dibolak-balik perlahan-lahan hingga tercampur. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37 0C selama 1 jam. Selanjutnya ditambahkan 100 µl 5 M NaCl dan 100 µl 10% CTAB/NaCl yang telah dihangatkan terlebih dahulu (65 0C) selanjutnya diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65 0C. Kemudian ditambahkan 500 µl campuran phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) lalu divortex hingga tercampur. Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
Cairan yang terbentuk yang berada pada lapisan teratas dipindahkan ke dalam eppendroff baru lalu ditambahkan 0.6 volum isopropanol dingin. Tabung eppendorf dibolak-balik secara perlahan supaya tercampur selanjutnya selama 20 menit disimpan di suhu -20 0C. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan maksimal selama 5 menit pada suhu -4 0C. Supernatan yang ada dibuang.
16
Selanjutnya ditambahkan 1 ml etanol 70% dingin lalu disentrifugasi lagi pada kecepatan maksimum selama 2 menit. Supernatan dibuang kembali, lalu disimpan di suhu ruang hingga etanol menguap habis. Sebelum disimpan DNA ditambah dengan elution buffer atau aquabidest steril serta dilakukan pengecekan dengan elektroforesis.
b. Amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR
Primer yang digunakan adalah primer universal untuk domain bakteri berupa forward primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan reverse primer 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al., 1998). Semua komponen reaksi dicampur dalam microtube dan dimasukkan dalam mesin PCR. Tahapan PCR terdiri dari pre start 94 0C, 2 menit; tahap denaturasi 92 0C, 30 detik; tahap annealing 55 0C, 30 detik, tahap elongasi 72 0C selama 1 menit. Proses PCR terdiri dari 30 siklus. Selanjutnya post PCR pada suhu 75 0C 20 menit dan tahap stop PCR pada suhu 4 0C. Kemudian hasil PCR disimpan pada suhu -20 0C.
c. Gene clean
DNA produk PCR dimurnikan menggunakan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit, Geneaid. Sebanyak 300 mg agarose (hasil pemotongan pada elektroforesis) dimasukkan dalam eppendorf. Kemudian ditambahkan 500 µl DF buffer dan divortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-60 0C selama 15 menit hingga agarose terlarut sempurna. Kemudian 800 µl sampel dimasukkan ke dalam DFcolumn dan disentrifugasi 13000 rpm selama 30 detik dan supernatan dibuang. Selanjutnya ditambahkan 600 µl wash buffer yang telah ditambahkan etanol ke dalamnya, lalu disentrifugasi 13000 rpm selama 30 detik. Supernatan yang ada dibuang lalu disentrifugasi kembali selama 3 menit pada kecepatan penuh. DF column dipindahkan pada eppendorf baru dan ditambahkan 15-50 µl aquabidest steril pada bagian tengahnya. Selanjutnya didiamkan selama 2 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan penuh selama 2 menit. Kemudian DNA yang terbentuk disimpan pada suhu -20 0C. Untuk pengecekan dapat dilakukan running elektroforesis DNA hasil gene clean (Lampiran 2).
Rancangan Penelitian dan Teknik Analisa
Penelitian dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), sebelas perlakuan dengan tiga ulangan pada saat uji patogenisitas dan dua belas perlakuan dengan tiga ulangan pada uji in vivo. Parameter yang diamati dianalisa keragamannya dengan ANOVA dan untuk mengetahui pengaruh perlakuan dilakukan uji lanjut. Variabel yang dianalisa secara statistik meliputi kelangsungan hidup larva udang baik pada uji patogenisitas maupun uji in vivo serta laju pertumbuhannya. Sedangkan nilai zona hambat dan populasi bakteri dianalisa secara deskriptif.
Parameter yang diamati
a. Tingkat Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu
Tingkat kelangsungan hidup larva udang windu dihitung menggunakan rumus :
SR=Nt x 100% (Effendie, 1997) No
Keterangan :
SR : tingkat kelangsungan hidup (%)
Nt : jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No : jumlah udang pada awal pengamatan
b. Laju Pertumbuhan Panjang dan Bobot Harian Larva Udang Windu Pertumbuhan panjang dan bobot total diamati pada awal dan akhir penelitian. Pertumbuhan larva udang windu dihitung berdasarkan pertambahan bobot dan panjang berdasarkan rumus berikut :
⎪⎭ ⎪ ⎬ ⎫ ⎪⎩ ⎪ ⎨ ⎧ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ − = 1 x100% Lo Lt t α dan ⎪⎭ ⎪ ⎬ ⎫ ⎪⎩ ⎪ ⎨ ⎧ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ − = 1 x100% Wo Wt t α (Effendie, 1997) Keterangan :
α : Laju pertumbuhan harian udang (%) t : Lama waktu pemeliharaan udang (hari) Wt : Bobot rata-rata akhir udang (mg) Wo : Bobot rata-rata awal udang (mg) Lt : Panjang rata-rata akhir udang (mm) Lo : Panjang rata-rata awal udang (mm)
18
c. Populasi Bakteri
Populasi bakteri yang dihitung pada uji in vitro metode kultur bersama adalah jumlah V. harveyi MR5339 RfR pada tabung kontrol dan kultur campuran probiotik. Pada uji in vivo populasi bakteri yang dihitung meliputi total bakteri, jumlah bakteri probiotik, jumlah V. harveyi MR5339 RFR, baik pada media pemeliharaan, larva udang mati dan udang hidup. Jumlah bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
Isolasi Bakteri Kandidat Probiotik
Terumbu karang yang diisolasi bakterinya terdiri dari 6 jenis yaitu Acropora sp., Merulina sp., Hystrix sp., Poecillophora sp., Porites sp. dan Haliophora sp. (Gambar 2). Identifikasi terumbu berdasarkan Veron (1986). Bakteri kandidat probiotik yang berhasil diisolasi dari terumbu karang ada 110 isolat (Lampiran 3). Dari jumlah tersebut 43 isolat berasal dari Acropora sp., 9 isolat dari Merulina sp., 12 isolat dari Hystrix sp., 14 isolat dari Poecillophora sp., 22 isolat dari Porites sp. dan 10 isolat dari Haliophora sp.. Dari total 110 isolat, 82 isolat termasuk golongan Vibrio sp dan 28 isolat dari golongan non Vibrio. Koloni 82 isolat Vibrio berwarna kuning pada media TCBS-agar, tidak berpendar dan bersifat menyebar pada media SWC-agar. Sedangkan 17 isolat non Vibrio menghasilkan koloni berwarna krem dan 11 isolat menghasilkan koloni berwarna putih pada media SWC-agar.
V. harveyi yang digunakan dalam penelitian ini adalah V. harveyi MR5339 RfR, merupakan koleksi Balai Penelitian Perikanan Pantai (Balitkanta) Maros, Sulawesi Selatan. Bakteri tersebut telah diuji bersifat patogen pada larva udang windu. Koloni V. harveyi MR5339 RfR berwarna hijau pada media TCBS-agar dan putih kekuningan pada media SWC-agar (Gambar 3) serta berpendar bila diamati pada ruang gelap (Gambar 4).
Acropora sp. Merulina sp. Hystrix sp.
Poecillophora sp. Porites sp. Haliophora sp. Gambar 2. Terumbu karang yang diisolasi bakterinya
20
A B
Gambar 3. Penampilan V. harveyi MR5339 RfR pada media TCBS-agar (A) dan SWC-agar (B)
A B
Gambar 4. Penampilan bakteri V. harveyi MR5339 RfR pada media TCBS-agar yang diamati pada kondisi terang (A) dan gelap (B)
Uji In Vitro Bakteri Kandidat Probiotik a. Metode Zona hambat
Bakteri yang memiliki kemampuan menghambat V. harveyi MR5339 RfR menghasilkan zona bening disekitar kertas cakram (Gambar 5). Bakteri yang tidak menghasilkan zona bening diuji kemampuannya menghambat V. harveyi MR5339 RfR dengan metode kultur bersama.
Dari 110 isolat hanya 54 isolat yang mampu menghasilkan zona hambat. Zona hambat yang dihasilkan berkisar antara 8 – 15 mm (Tabel 1). Ada lima isolat yang menghasilkan zona hambat terbesar, yaitu yang diisolasi dari Acropora sp. (isolat 1C dan 8A), Hystrix sp. (isolat 11D dan 11K)dan Poecillophora sp. (isolat 13I). Radjasa et al. (2004) berhasil mengisolasi TAB4.2 dari Acropora sp yang menghasilkan zona bening 11,75 mm saat uji in vitro dengan V. harveyi. TAB4.2 diidentifikasi sebagai Pseudoalteromonas dan menghasilkan metabolit sekunder berupa polipeptida (Radjasa et al. 2004).
Kontrol A1 A2 A3 Kontrol Kontrol B3 C3 B2 B1 C2 C1
22
Keterangan :
A : isolat 1C C : isolat 13I E : isolat 11K B : isolat 8A D : isolat 11D
Gambar 5. Zona hambat yang dihasilkan bakteri kandidat probiotik terhadap V. harveyi MR5339 RfR Kontrol Kontrol D3 E2 D2 D1 E3 E1
Tabel 1. Zona hambat yang dihasilkan oleh bakteri kandidat probiotik No Kode isolat Zona hambat (mm) No Kode isolat Zona hambat (mm)
1 Acp 1C 13.8 28 Lam 4I 9 2 Acp 1D 10 29 Lam 4J 8 3 Acp 1F 8 30 Acp 6D 8 4 Acp 1G 8 31 Acp 6E 8 5 Acp 1H 8 32 Acp 6F 8 6 Acp 3A 9 33 Acp 6G 11 7 Acp 3B 8 34 Fol 7H 9.2 8 Acp 3E 8 35 Fol 7I 8
9 Acp 2B 8 36 Fol 7A1 8
10 Acp 2C 10 37 Fol 7A2 11
11 Acp 2D 9 38 Hal 9B 11
12 Acp 2E 9 39 Hal 9C 10
13 Acp 2F 8 40 Hal 9E 8
14 Acp 2G 8 41 Hal 9G 8
15 Acp 2H 11 42 Hal 9I 8
16 Acp 8A 12.4 43 Acp 13A 10
17 Acp 8E 8 44 Acp 13C 8.3
18 Acp 5C 8 45 Acp 13I 15
19 Acp 5D 8 46 Acp 11D 12.5
20 Acp 5E 10 47 Acp 11H1 9
21 Acp 5F 10 48 Acp 11K 12.5
22 Lam 4B 10 49 Hal 12A 8
23 Lam 4C 9 50 Hal 12B 9.1
24 Lam 4D 9 51 Hal 12C 10
25 Lam 4E 9 52 Hal 12A2 10
26 Lam 4G 9 53 Hal 12A3 11
27 Lam 4H 9 54 Hal 12C2 8
Zona bening yang timbul di sekitar kertas cakram menunjukkan adanya kemampun bakteri kandidat probiotik dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR. Berdasarkan Verschuere et al. (2000) populasi mikroba dapat melepaskan substansi kimia yang memiliki kemampuan bakterisidal atau bakteriostasis yang dapat mempengaruhi populasi mikroba lain. Secara umum kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri lain dikarenakan satu atau kombinasi dari beberapa faktor seperti: produksi antibiotik, bakteriosin, siderophores, lysozymes, protease dan atau hidrogen peroksida atau mempengaruhi pH media dengan menghasilkan asam organik tertentu.
24
Hasil uji penghambatan in vitro dari 56 isolat bakteri kandidat probiotik terhadap V. harveyi MR5339 RfR disajikan pada Gambar 6 dan 7. Uji in vitro bakteri kandidat probiotik dengan metode kultur bersama dilakukan dengan membandingkan jumlah koloni V. harveyi MR5339 RfR yang tumbuh di tabung kontrol dengan kultur campurannya (Gambar 6). Lima isolat kandidat probiotik yaitu isolat 5H1 diisolasi dari Acropora sp., isolat 11I dan 11G diisolasi dari Hystrix sp. serta isolat 13B dan 13G1 yang diisolasi dari Poecillophora sp., mampu menekan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR hingga 101 – 102 CFU/ml sedangkan pada tabung kontrol populasi V. harveyi mencapai 7 x 108 CFU/ml. Isolat-isolat yang lain juga mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR meskipun dengan daya hambat yang berbeda-beda (Gambar 7). Hal ini terlihat dari jumlah koloni V. harveyi MR5339 RfR yang tumbuh pada biakan yang dicampur dengan bakteri kandidat probiotik lebih rendah dibanding kontrol. Hal tersebut menunjukkan bahwa ke-56 isolat yang ada, sebenarnya potensial menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR.
Penghambatan pertumbuhan bakteri tidak selalu dapat diamati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Komposisi media yang digunakan mungkin mempengaruhi jumlah senyawa antimikrob yang dihasilkan atau dilepaskan ke media. Selain itu, penghambatan pertumbuhan tidak selalu berkaitan dengan produksi senyawa antimikrob tetapi dapat juga karena adanya kompetisi terhadap bahan kimia atau energi yang tersedia. Hal ini menggambarkan bagaimana populasi bakteri yang berbeda menempati ekosistem yang sama (Verschuere et al. 2000).
Hasil penelitian Riquelme et al. (1997) menunjukkan bahwa dari 57 isolat bakteri yang diisolasi dari air laut, 3 diantaranya (5%) potensial menghambat pertumbuhan V. anguillarum. Isolat SV1 yang tidak memperlihatkan adanya zona penghambatan pada uji in vitro ternyata juga dapat meningkatkan kelangsungan hidup kerang-kerangan pada uji in vivo (Riquelme et al. 1997).
Gambar 6. Penghambatan V. harveyi MR5339 RfR oleh bakteri kandidat probiotik pada media SWC-agar + rifampisin 50 µg/ml
Kontrol (V. harveyi)
Kultur campuran (V. harveyi + isolat 11I)
Kontrol
(V. harveyi) (V. harveyi)Kontrol
Kontrol
(V. harveyi) (V. harveyi)Kontrol
Kultur campuran
(V. harveyi + isolat 5H1) Kultur campuran
(V. harveyi + isolat 13B)
Kultur campuran (V. harveyi + isolat 11G)
Kultur campuran (V. harveyi + isolat 13G1)
25
Gambar 7. Penghambatan V. harveyi MR5339 RfR oleh isolat bakteri kandidat probiotik pada uji in vitro metode kultur bersama
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Isolat kandidat probiotik
Lo g C F U /m l s el V. harv ey i
Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik
Sebelum dilakukan uji in vivo pada larva udang, sepuluh isolat yang potensial sebagai kandidat probiotik, masing-masing lima isolat dari metode zona hambat dan lima isolat dari metode kultur bersama, diuji patogenisitasnya terhadap larva udang windu. Isolat-isolat terpilih merupakan isolat yang memberikan hasil terbaik pada uji in vitro metode zona hambat dan kultur bersama. Hasil uji patogenisitas isolat-isolat kandidat probiotik disajikan pada Gambar 8 dan Lampiran 4. Hasil yang ada memperlihatkan semua bakteri kandidat probiotik yang diuji tergolong tidak patogen. Hal ini dapat diketahui dengan melihat nilai kelangsungan hidup pada semua perlakuan tidak berbeda nyata dengan kontrol setelah dianalisa secara statistik. Isolat 13G1 yang mampu menekan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR paling baik pada uji in vitro metode kultur bersama menghasilkan kelangsungan hidup paling tinggi (88,33%). Hal ini menunjukkan isolat tersebut, diduga selain memiliki kemampuan menekan pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR juga dapat meningkatkan kebugaran udang.
Gambar 8. Kelangsungan hidup larva udang windu pada uji patogenisitas
a a a a a a a a a a 86,67 86,67 83,33 85,00 88,33 86,67 83,33 83,33 81,67 83,33 80,00 a 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0 1C 5H1 11 G 13 I 13 G 1 13 B 8 A 11 I 11 D 11 K Ko nt r o l Isolat kandidat probiotik
K e la ngs unga n hi d up l a rv a u da ng (% )
27
Ciri Fisik Isolat Terpilih
Dari hasil seleksi pada uji in vitro dihasilkan empat isolat potensial yang mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi, tidak bersifat patogen pada larva udang serta menghasilkan kelangsungan hidup yang lebih baik dibanding kontrol pada uji patogenisitas. Keempat isolat tersebut adalah 13G1, 13B, 1C dan 8A. Isolat pertama, 13G1 diisolasi dari Poecillopohora sp., berwarna krem keputihan dan menyebar pada media SWC (Gambar 9A), bentuk koloni bulat cembung. Pada media selektif TCBS isolat 13G1 dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 9B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.
A B
Gambar 9. Penampilan isolat 13G1 pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).
Isolat kedua, 13B juga diisolasi dari Poecillopohora sp., berwarna putih kekuningan dan menyebar pada media SWC (Gambar 10A), bentuk koloni bulat datar. Pada media selektif TCBS isolat 13B dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 10B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.
A B
Gambar 10. Penampilan isolat 13B pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).
Isolat ketiga, 8A diisolasi dari Acropora sp., berwarna putih kekuningan dan menyebar pada media SWC (Gambar 11A), koloni berbentuk bulat kecil-kecil Gambar 8. Pada media selektif TCBS isolat 8A dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 11B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.
A B
Gambar 11. Penampilan isolat 8A pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B). Isolat keempat, 1C juga diisolasi dari Acropora sp., berwarna putih kekuningan pada media SWC (Gambar 12A), bentuk koloni bulat cembung. Pada media selektif TCBS isolat 1C dapat tumbuh dan berwarna kuning (Gambar 12B), tidak berpendar sehingga isolat ini termasuk kelompok Vibrio.
29 0 0.5 1 1.5 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Nilai O D (6 00 nm ) Jam ke 0 0.5 1 1.5 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Nilai O D (6 00 nm ) Jam ke 0 0.5 1 1.5 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 N ilai O D (600 n m ) Jam ke 13B 13BRf A B
Gambar 12. Penampilan isolat 1C pada media SWC-agar (A) dan TCBS-agar (B).
Mutan Resisten Rifampisin
Empat isolat terbaik hasil uji patogenisitas yaitu 13G1, 13B, 1C dan 8A dibuat mutan resisten rifampisin dengan cara menumbuhkan isolat-isolat tersebut pada media SWC-agar yang mengandung rifampisin 50 µg/ml. Morfologi koloni mutan maupun pola pertumbuhannya sama dengan tipe liarnya (Gambar 13), sehingga mutan tersebut dapat digunakan untuk mengamati penghambatan pertumbuhan V. harveyi oleh bakteri kandidat probiotik. Pemberian penanda RfR pada bakteri probiotik bertujuan untuk membedakan antara bakteri probiotik dengan bakteri alami yang telah ada pada tubuh udang, sehingga dapat dimonitor keberadaannya. 0 0.5 1 1.5 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 N ilai O D (600 n m ) Jam ke 13 G1 13 G1 Rf
Gambar 13. Perbandingan pertumbuhan bakteri kandidat probiotik resisten rifampisin dengan tipe liarnya.
Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik
Empat isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial berdasarkan uji in vitro metode zona hambat dan kultur bersama serta tidak bersifat patogen terhadap larva udang diuji efektivitasnya dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR pada larva udang windu. Pengamatan dilakukan terhadap kelangsungan hidup larva, total bakteri, populasi V. harveyi MR5339 RfR dan bakteri kandidat probiotik baik pada air media pemeliharaan, larva hidup maupun larva mati. Penanda RfR pada V. harveyi dan probiotik yang digunakan bertujuan untuk mengamati perbandingan populasi keduanya
Hasil pengujian menunjukkan keempat isolat tersebut, baik tipe liar (Gambar 14, Lampiran 5) maupun tipe mutannya (Gambar 15, Lampiran 6), secara signifikan (p<0.05) dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang. Isolat-isolat tersebut diduga dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi MR5339 RfR. Hal ini terlihat dari nilai kelangsungan hidup larva pada kontrol positif (hanya diinokulasi V. harveyi MR5339 RfR) lebih rendah (61,67% dan 68,33%) dibanding perlakuan dengan penambahan isolat probiotik (83,33% - 88,33%). Selain itu isolat-isolat tersebut juga diduga dapat meningkatkan kebugaran larva udang.
Berdasarkan Verschuere et al. 2000, bakteri probiotik dapat menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nutrisinya juga memperbaiki respon inang terhadap penyakit. Kedua hal tersebut diduga menjadi penyebab meningkatnya kebugaran larva udang. Hal ini terlihat dari nilai
