Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode eksperimental yang meliputi isolasi protein, hidrolisis protein dengan variasi waktu 1 jam, 3 jam, 5 jam, serta uji aktivitas antibakteri isolat dan hidrolisat protein. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Mikrobiologi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
3.1. Alat dan Bahan Penelitian 3.1.1 Alat Penelitian
Alat – alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf (Express equipment), neraca analitik, batang pengaduk, beaker glass, cawan petri, hot plate, inkubator (Memmert), jangka sorong (Electric Digital Capliper), jarum ose, Kain saring batis, Laminar Air Flow Cabinet (Astec HLF I200 L), lampu bunsen, lemari pendingin (Thermo Scientific), mikroskop (Zeiss), pinset, pipet mikro (Eppendorf), pH meter, tabung reaksi, timbangan analitik (Sartorius), oven (Memmert), pinset, saringan, sendok, spektrofotometer uv-vis, vortex (Biosan), water-bath shaker.
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah akuades, buffer A (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%), Bovine Serum Albumin (BSA), lowry A (larutan asam fosfotungstat-phospomolybdat dengan akuades 1:1), lowry B (Na2CO3 2%, NaOH 0,1 N, CuSO4.5H2O 1%, Natrium Kalium Tatrat 2%), kerang darah
19
(Anadara granosa L), Tripsin. Media yang digunakan adalah nutrient agar (Himedia), nutrient broth (Himedia), mueller hintoon agar (Himedia.) Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, stok kultur murni koleksi Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.2. Pembuatan Pereaksi 3.2.1 Buffer A
Buffer A (tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%) dibuat dengan cara menambahkan tris (Hidroksimetil) aminometana sebanyak 6,05 gram, NaCl sebanyak 58,5 gram, dan 0,555 gram CaCl2 dilarutkan dengan akuades. Ditambahkan dengan HCl sampai pH 8,3. Ditambahkan β-mercaptoetanol 1% sebanyak 15 mL triton X-100 0,5% sebanyak 2,5 mL. Dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 500 ml, kemudian dihomogenkan (Niche dkk., 2017).
3.2.2 Lowry A
Folin Clocalteu sebanyak 2 ml ditambahkan akuades, kemudian dihomogenkan (Niche, dkk., 2017).
3.2.3 Lowry B
Na2CO3 2% dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1 N. Ditambahkan 1 mL Na-K-Tatrat 2% dan 1 mL CuSO4.5H2O 1% kemudian dihomogenkan. (Niche, dkk., 2017).
3.3. Isolasi Protein Kerang Darah
Kerang darah ditimbang sebanyak 500 gram berat segar, dihaluskan dengan 800 mL pelarut buffer A menggunakan blender, kemudian di saring
20
dengan kain saring batis. Kemudian filtrat yang diperoleh dibeku-cairkan sebanyak 2-3 kali lalu disentrifugasi pada 6000 rpm suhu 4°C selama 30 menit, selanjutnya supernatan disimpan dalam lemari pendingin sebelum dilanjutkan pengujian kadar protein ekstrak kasar protein dan proses pemurnian (Niche, dkk., 2017).
3.4. Hidrolisis Protein Kerang Darah
Sebanyak 45 mL isolat protein dimasukkan ke dalam erlenmeyer.
Ditambahkan 7,5 mL enzim tripsin 1%, (perbandingan enzim – substrat yaitu 1:
6). Diatur pH 8 dengan penambahan HCl 0,5 N. Dimasukkan ke dalam waterbath shaker pada suhu 37˚C, selama 1 jam, 3 jam , 5 jam. Dihentikan hidrolisis dengan pemanasan pada suhu 90˚C selama 15 menit (Asmi dkk, 2019).
3.5. Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry (1951), menggunakan BSA sebagai standar. Dilakukan pengenceran larutan sampel dengan cara diambil 0,5 ml, dimasukkan ke dalam labu 100 mL dan dicukupkan dengan akuades. Ke dalam vial 10 mL dimasukkan 2 mL larutan sampel yang telah diencerkan lalu ditambahkan 2,75 mL pereaksi Lowry B. Larutan campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 10-15 menit pada suhu kamar.
Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL pereaksi Lowry A, dihomogenkan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Absorbansinya kemudian diukur pada panjang gelombang maksimum (λmax). Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara mensubtitusikan absorbansi larutan ke dalam persamaaan regresi kurva kalibrasi larutan standar protein (Niche, dkk., 2017).
21 3.6. Pembuatan Media
3.6.1. Media Nutrient Agar
Komposisi : Peptone 5 g Sodium chloride 5 g HM peptone 1,5 g Yeast extract 1,5 g
Agar 15 g
Cara pembuatan :
Sebanyak 28 g nutrient agar (NA) dimasukkan kedalam Erlenmeyer tambahkan air suling 1000 mL, lalu dipanaskan sampai larut sempurna.
Kemudian disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Himedia, 2005).
3.6.2. Media Nutrient Broth
Komposisi : Peptone 5 g Sodium chloride 5 g Beef extract 1.5 g Yeast extract 1.5 g Cara pembuatan:
Sebanyak 13,0 gram serbuk nutrient broth dilarutkan kedalam 1000 mL air suling. Dipanaskan jika perlu untuk melarutkan media secara sempurna.
Kemudian disterilkan di autoklaf pada 121°C selama 15 menit (Himedia, 2005).
22 3.6.3. Media Mueller Hinton Agar
Komposisi : Beef infusion from 300 g Casein acid hydrolysate 17.5 g
Starch 1.5 g
Agar 17g
Cara pembuatan:
Sebanyak 38,0 gram serbuk Mueller Hinton Agar ditimbang, disuspensikan ke dalam 1000 ml air suling. Dipanaskan hingga sampai bahan larut sempurna lalu disterilkan di dalam autoklaf pada 121°C selama 15 menit (Himedia, 2005).
3.7. Pembuatan Larutan Uji Dengan Berbagai Konsentrasi
Larutan uji masing - masing isolat dan hidrolisat 1,3 dan 5 jam dibuat dalam berbagai konsentrasi, yaitu 100% (tanpa pengenceran), selanjutnya dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 75%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% (%v/v).
3.8. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven pada 170ºC selama 1 jam. Media pertumbuhan bakteri disterilkan di autoclaf pada 121ºC selama 15 menit. Sedangkan jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan nyala bunsen (Lay dan Sugiyo, 1994).
23 3.9. Pembiakan Bakteri
3.8.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dengan jarum ose steril, lalu diinokulasikan pada permukaan media agar miring dengan cara menggores kemudian diinkubasikan pada suhu 37˚C selama 24 jam (Nasri, 2019).
3.8.2 Pembuatan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 mL media nutrient broth (Mambang dkk., 2014). Diukur transmitan pada panjang gelombang 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-Visibel. Target nilai transmitan lebih kurang 25% pada panjang gelombang 580 nm (Depkes RI, 2020).
3.10. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar dalam 3 pengulangan. Suspensi bakteri diambil sebanyak 0,1 mL, dihomogenkan dalam cawan petri yang steril. Kemudian sebanyak 15 mL Mueller Hinton Agar cair dituang ke dalam cawan petri yang telah terisi bakteri dan homogenkan kembali sampai media memadat. Selanjutnya, media dilubangi dengan alat pelubang gabus berdiameter 6 mm. Kemudian masing – masing lubang sumur diberikan 25 µL larutan uji setiap konsentrasi menggunakan mikropipet. Media Mueller Hinton Agar yang telah diberikan perlakuan tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C tanpa dibalik. Setelah diinkubasi, hasil aktivitas antibakteri dapat diamati secara visual dengan mengukur diameter zona hambat atau zona bening di sekitar sumuran menggunakan jangka sorong (Chandra dkk., 2018). Langkah kerja penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
24 BAB IV