i
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ISOLAT DAN HIDROLISAT PROTEIN KERANG DARAH (Anadara granosa L)
SKRIPSI HALAMAN JUDUL
OLEH :
VIVIENNE WIJAYA NIM 171501050
PROGRAM SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2021
ii
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ISOLAT DAN HIDROLISAT PROTEIN KERANG DARAH (Anadara granosa L)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
OLEH :
VIVIENNE WIJAYA NIM 171501050
PROGRAM SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2021
PENGESABAN SKRIPSI
u n
AK11VIT AS ANTIBAKTERI ISOLAT DAN BIDROLISAT PROTEIN KERANG DARAH (A • JNII . . L)OLI.II:
VIVIENNE WUA YA NIM 171!11158
Dipertahanbn di Hadapln Penguji Skripli Fakultas Fanwi Uui\'asibd Sumlten Utara pada TIIIIPI: OI Juni 2021
Disetujui oleh:
~
b"ig )
Sri Yul"
:·
i. S.Fann.,M.Si., AptNIP.
198207032001122002 Pembimbing II.YodeW:.::.-:.Farm,
M.Si, Apt.NIP. 191704212017042001
Ketua Pqnm Studi Sarjana Farmasi,
-
Dr. Sumaiyah, .Si., Apt.
NIP. l 977 l 2262008122002
Panitia
"'-JL
~
Prof.Dr.rer.nat.Effi:ady De Lux Pun, SU., Apt
NIP.
195306191913031001Sri ~.Fam.,M.Si, Apt NIP. l 98207032008122002
Dr. SitOnls, M.Si., Apt.
NIP. 195310301980031002
ftnlna1a, S.f 11111., M.Si .. Apt.
704212017042001
., ~ Pa.I)., Apt.
l S2008122001
iii
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menjalani penelitian hingga akhirnya menyelesaikan penyusunan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah (Anadara granosa L.)”.
Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada Ibu Sri Yuliasmi, S.Farm., M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing I dan Ibu Yade Metri Permata, S.Farm., M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing II , yang telah membimbing dengan penuh kesabaran, tulus dan ikhlas selama penelitian dan penulisan skripsi ini berlangsung. Penulis juga berterimaksih kepada Bapak Prof. Dr.rer.nat.
Effendy De Lux Putra, SU., Apt. dan Bapak Dr. Panal Sitorus., M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang membangun demi kelengkapan skripsi ini. Pada kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Ibu Khairunnisa, S.Si., M.Pharm., Ph.D., Apt., yang telah memberikan fasilitas selama masa pendidikan.
Penulis juga menyampaikan rasa terimakasih dan penghargaan yang tulus kepada kedua orang tua, Ayahanda Ng Kian Tjai dan Ibunda Ong Kui Bie, kepada abang saya David, kakak yaitu Fiona dan Intan serta adik saya Vonny, atas doa, dukungan dan pengorbanan baik moril maupun materil selama perkuliahan hingga penyelesaian skripsi ini. Penulis juga ingin mengucapkan terimakasih kepada rekan penelitian, sahabat dan teman-teman yang telah memberikan dukungan selama masa perkuliahan, penelitian dan penulisan skripsi ini berlangsung.
v
Skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, oleh karena itu penulis meminta maaf atas kesalahan dan kekhilafan dalam penulisan skripsi. Penulis bersedia menerima kritik dan saran yang membangun dari pembaca. Semoga skripsi inii bisa memberikan sumbangsih untuk menambah pengetahuan para pembaca dan berguna untuk ilmu pengetahuan.
Medan, 08 Juni 2021
Vivienne Wijaya NIM 171501050
vi
SURAT PERNYATAAN ORISINILITAS
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama : Vivienne Wijaya
Nomor Induk Mahasiswa : 171501050 Program Studi : Sarjana Farmasi
Judul Skripsi : Uji Aktivitas Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah (Anadara granosa L.) Dengan ini menyatakan bahwa skripsi yang saya buat adalah asli karya sendiri dan bukan plagiat. Apabila dikemudian hari diketahui bahwa skripsi saya tersebut terbukti plagiat karena kesalahan sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Sarjana Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikian surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan dalam keadaan sehat.
Medan, 08 Juni 2021
Vivienne Wijaya NIM 171501050
vii
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI ISOLAT DAN HIDROLISAT PROTEIN KERANG DARAH (Anadara granosa L)
ABSTRAK
Latar Belakang : Selama dekade terakhir beberapa tipe antibiotika yang dikembangkan untuk keperluan klinis belum cukup untuk mengatasi laju kecepatan resistensi bakteri. Oleh karena itu, dicari alternatif pengganti antibiotika yang aman dan tidak menimbulkan efek samping yang merugikan, salah satunya adalah peptida antimikroba (Antimicrobial peptides). Kerang darah (Anadara granosa L) adalah salah satu jenis bivalvia, dan merupakan sumber protein hewani yang tergolong dalam Complete Protein, karena kadar asam amino essensialnya yang tinggi.
Tujuan : Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui kandungan protein terlarut serta aktivitas antibakteri dalam isolat dan hidrolisat protein kerang darah (Anadara granosa L) terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
Metode : Pada penelitian ini dilakukan proses isolasi protein kerang darah (Anadara granosa L) menggunakan larutan buffer A (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3;
NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%) dan dilakukan proses hidrolisis dengan enzim tripsin. Pengukuran kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry dengan menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin) sebagai larutan standar. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan menentukan Konsentrasi Hambat Minimum.
Hasil : Penelitian ini menunjukkan bahwa kerang darah mengandung protein dengan konsentrasi protein pada isolat yaitu 32,445 mg/ml, hidrolisat 1 jam yaitu 34,65 mg/ml, hidrolisat 3 jam yaitu 36,435 mg/ml, dan pada hidrolisat 5 jam yaitu 39,48 mg/ml. Pada hasil pengujian, aktivitas antibakteri tertinggi terdapat pada hidrolisat 5 jam terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus masing – masing sebesar 12,23 ± 0,12 mm dan 14,03 ± 0,15 mm pada konsentrasi 100%.
Dengan konsentrasi hambat minimum pada isolat yaitu 50%, pada hidrolisat 1 jam yaitu 50%, hidrolisat 3 jam yaitu 25% dan pada hidrolisat 5 jam yaitu 25%
terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
Kesimpulan : Kerang darah (Anadara granosa L) memiliki kandungan protein yang berbeda pada masing – masing perlakuan dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
Kata kunci : Kerang darah, Protein, Hidrolisat Protein, Antibakteri, Escherichia coli, Staphylococcus aureus.
viii
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ISOLATE AND HYDROLYSATE PROTEIN FROM BLOOD COCKLES (Anadara granosa L)
ABSTRACT ABSTRACT
Background: Over the last decade several types of antibiotics were developed for clinical purposes has not been enough to overcome bacterial resistance rate of speed. Therefore, alternatives to antibiotics that are safe and do not cause adverse side effects are sought, one of which is antimicrobial peptides (AMPs). Blood cockle (Anadara granosa L) is a type of bivalve and is a source of animal protein which is classified as Complete Protein, because of its high essential amino acid levels.
Objective: The purpose of this study was to determine the dissolved protein content and antibacterial activity in blood cockle (Anadara granosa L) protein isolates and hydrolyzates against Escherichia coli and Staphylococcus aureus bacteria.
Method: In this study, the isolation process of blood cockle protein (Anadara granosa L) was carried out using buffer A (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M;
CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%) solution and hydrolysis was carried out with trypsin enzyme. Measurement of protein content was determined based on the Lowry method using BSA (Bovine Serum Albumin) as the standard solution. Antibacterial activity was carried out by the agar diffusion method against Escherichia coli and Staphylococcus aureus by determining the Minimum Inhibitory Concentration.
Results: This study showed that blood cockles contained a protein with a protein concentration in the isolate that was 32.445 mg/ml, 1-hour hydrolyzate was 34.65 mg/ml, 3 hours hydrolyzate was 36.435 mg/ml, and 5 hours hydrolyzate was 39.48 mg/ml. In the test results, the highest antibacterial activity was found in the 5-hour hydrolyzate against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, respectively 12.23 ± 0.12 mm and 14.03 ± 0.15 mm at a concentration of 100%.
The minimum inhibitory concentration of the isolate is 50%, the 1-hour hydrolyzate is 50%, the 3 hours hydrolyzate is 25%, and the 5 hours hydrolyzate is 25% against Escherichia coli and Staphylococcus aureus.
Conclusion: Blood cockles (Anadara granosa L) contained different proteins in each treatment and had antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus.
Keywords: Blood cockle, Protein, Protein Hydrolysate, Antibacterial, Escherichia coli, Staphylococcus aureus.
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
KATA PENGANTAR ... iii
SURAT PERNYATAAN ORISINILITAS... vi
ABSTRAK ... vii
ABSTRACT ... viii
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xiii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Rumusan Masalah ... 3
1.3. Hipotesis Penelitian ... 3
1.4. Tujuan Penelitian ... 3
1.5. Manfaat Penelitian ... 4
1.6. Kerangka Pikir Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 5
2.1. Kerang Darah ... 5
2.2. Protein ... 6
2.3. Hidrolisis Protein ... 9
2.4. Bakteri... 11
2.4.1. Escherichia coli ... 11
2.4.2. Staphylococcus aureus... 12
2.5. Senyawa Antibakteri ... 12
2.6. Uji Aktivitas Antibakteri ... 14
BAB III METODE PENELITIAN... 18
3.1. Alat dan Bahan Penelitian ... 18
3.1.1 Alat Penelitian ... 18
3.1.2 Bahan Penelitian ... 18
3.2. Pembuatan Pereaksi ... 19
3.2.1 Buffer A ... 19
3.2.2 Lowry A ... 19
3.2.3 Lowry B ... 19
3.3. Isolasi Protein Kerang Darah ... 19
3.4. Hidrolisis Protein Kerang Darah ... 20
3.5. Penentuan Kadar Protein ... 20
3.6. Pembuatan Media ... 21
3.6.1. Media Nutrient Agar ... 21
3.6.2. Media Nutrient Broth ... 21
3.6.3. Media Mueller Hinton Agar ... 22
3.7. Pembuatan Larutan Uji Dengan Berbagai Konsentrasi ... 22
3.8. Sterilisasi Alat dan Bahan ... 22
3.9. Pembiakan Bakteri ... 23
3.8.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri ... 23
3.8.2 Pembuatan Inokulum Bakteri ... 23
3.10. Pengujian Aktivitas Antibakteri ... 23
x
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24
4.1. Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah... 24
4.2. Pengukuran Kadar Protein Terlarut ... 25
4.2.1. Hasil Penentuan Absorbsi Maksimum... 25
4.2.2. Pengukuran Kurva Kalibrasi Larutan Standar BSA ... 25
4.2.3. Pengukuran Kadar Protein Terlarut ... 26
4.3. Aktivitas Antibakteri Protein Kerang Darah ... 27
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 32
5.1. Kesimpulan ... 32
5.2. Saran ... 32
DAFTAR PUSTAKA ... 33
xi
DAFTAR TABEL
4.1. Hasil Pengukuran Kadar Protein Kerang Darah (Anadara granosa L) ... 26 4.2. Hasil Uji Antibakteri Isolat dan Hidolisat Protein Kerang Darah Terhadap Escherichia coli ... 27 4.3. Hasil Uji Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Terhadap Staphylococcus aureus ... 28 4.4. Hasil Uji Antibakteri Antibiotik Amoxicillin Trihydrate Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus ... 29
xii
DAFTAR GAMBAR
1.1. Kerangka Pikir Penelitian...4
1.2. Isolat Protein Kerang Darah (Anadara granosa L) ... 24
1.3. Kurva Absorbsi Maksimum ... 25
1.4. Hasil Pengukuran Kurva Kalibrasi BSA ... 26
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
1. Bagan Kerja Penelitian ... 36
2. Gambar Kerang Darah ... 39
3. Perhitungan Kurva Standar BSA ... 40
4. Pengukuran Kadar Protein ... 41
5. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus ... 42
6. Gambar Hasil Uji Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus ... 44
7. Gambar Hasil Uji Antibakteri Antibiotik Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus ... 48
1 BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Selama dekade terakhir beberapa tipe antibiotika yang dikembangkan untuk keperluan klinis belum cukup untuk mengatasi laju kecepatan resistensi bakteri. Oleh karena itu, dicari alternatif pengganti antibiotika yang aman dan tidak menimbulkan efek samping yang merugikan, salah satunya adalah peptida antimikroba (Antimicrobial peptides: AMPs), baik yang tersedia secara natural maupun sintesis atau hasil hidrolisis enzimatik (Kusumaningtyas, 2013).
Biota laut menjadi target pencarian bahan antibiotik. Beberapa diantaranya telah dilaporkan mengandung berbagai jenis senyawa dengan bioaktivitas yang berbeda - beda mulai dari antibakteri, antifungi, antikanker dan sebagainya. Pengunaan protein sebagai bahan obat memiliki keunggulan yaitu dapat diterima dengan baik oleh tubuh dengan efek samping yang kecil (Sartika, dkk., 2014).
Perairan Indonesia kaya akan moluska, salah satunya adalah kerang darah (Anadara granosa L). Kerang adalah salah satu jenis bivalvia, dan merupakan sumber protein hewani yang tergolong dalam Complete Protein, karena kadar asam amino essensialnya yang tinggi (85% – 95%) protein yang terkandung didalam kerang jadi mudah dicerna oleh tubuh. Kerang darah berpotensi dan memiliki nilai ekonomis untuk dikembangkan sebagai sumber protein dan mineral untuk memenuhi kebutuhan pangan masyarakat Indonesia (Rosmawati, 2013).
2
Dewiningsih dkk. (2017) menyebutkan bahwa kerang darah (Anadara granosa L) merupakan salah satu biota laut yang memiliki potensi di bidang farmakologi sebagai antibakteri dan antimikroba.
Menurut Sugrani (2020) salah satu cara meningkatkan aktivitas protein adalah dengan memodifikasi protein melalui proses hidrolisis menjadi senyawa peptida yang lebih pendek.
Salah satu alternatif yang dapat dilakukan untuk memanfaatkan protein adalah melalui hidrolisis protein. Hidrolisat protein merupakan produk yang dihasilkan dari penguraian protein menjadi peptida sederhana dan asam amino melalui proses hidrolisis oleh enzim, asam atau basa (Witono, dkk., 2020).
Peptida antimikroba dinilai semakin menarik untuk menggantikan fungsi antibiotika karena penggunaannya lebih aman. Dalam beberapa tahun terakhir, yang menjadi perhatian terkait antibiotika adalah antibiotik yang dikembangkan belum mampu untuk mencegah kecepatan resistensi bakteri. Penggunaan peptida antimikroba diharapkan dapat menjadi alternatif pengganti antibiotika karena berasal dari protein sehingga aman dikonsumsi (Lestari dan Giordan, 2020).
Pada penelitian ini, dilakukan isolasi dan hidrolisis protein kerang darah (Anadara granosa L) serta uji aktivitas antibakterinya terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
3 1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka dapat diambil perumusan masalah sebagai berikut:
a. Berapakah jumlah protein dalam kerang darah (Anadara granosa L) tersebut?
b. Apakah isolat dan hidrolisat protein kerang darah (Anadara granosa L) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli?
1.3. Hipotesis Penelitian
Berdasarkan perumusan masalah diatas maka hipotesis analisis sebagai berikut:
a. Kerang darah (Anadara granosa L) mengandung protein.
b. Isolat dan hidrolisat protein kerang darah (Anadara granosa L) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
1.4. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah:
a. Untuk mengetahui jumlah protein kerang darah (Anadara granosa L).
b. Untuk mengetahui isolat dan hidrolisat protein kerang darah (Anadara granosa L) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
4 1.5. Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini, diharapkan dapat memberikan informasi terkait dengan proses isolasi dan hidrolisis protein kerang darah (Anadara granosa L) dan mengetahui aktivitas antibakterinya terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
1.6. Kerangka Pikir Penelitian
Kerangka pikir dapat dilihat pada Gambar 1.1 dibawah ini :
Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter
Kerang Darah
Isolat Protein
Hidrolisat Protein ( variasi waktu 1,3,
dan 5 jam)
Uji Kadar Protein
Uji Aktivitas Antibakteri
Kadar Protein
Diameter Zona Bening
Gambar 1.1. Kerangka Pikir Penelitian
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Kerang Darah
Kerang darah (Anadara granosa L) merupakan salah satu jenis kerang yang berpotensi dan bernilai ekonomis untuk dikembangkan sebagai sumber protein dan mineral untuk memenuhi kebutuhan pangan masyarakat Indonesia.
Kerang darah banyak ditemukan pada substrat yang berlumpur di muara sungai dengan tofografi pantai yang landai sampai kedalaman 20 m. Kerang darah bersifat infauna yaitu hidup dengan cara membenamkan diri di bawah permukaan lumpur di perairan dangkal (Nurjanah dkk., 2005).
Kerang darah mempunyai pigmen darah merah (hemoglobin), yang disebut bloody cockles sehingga kerang ini dapat hidup pada habitat yang kadar oksigennya relatif rendah, bahkan setelah dipanen masih bisa hidup walaupun tanpa air. Selain itu, adanya hemoglobin pada kerang darah inilah yang menyebabkan warna daging kerang menjadi merah (Solang, 2019). Sedangkan kerang yang mati cangkangnya agak terbuka dan sedikit menganga yang diikuti oleh bau segar yang perlahan-lahan berganti dengan bau busuk (amoniak) (Nurjanah dkk., 2005).
Kerang darah merupakan biota laut yang ditemukan di intertidal yang hidupnya di daerah berlumpur dengan salinitas yang relatif rendah. Kerang darah dapat beradaptasi dengan salinitas 14 – 300 dan suhu optimal berkisar antara 20 - 30 ° C. Kerang darah memiliki potensi yang cukup tinggi sebagai bahan pangan. Hal ini karena kerang darah berpotensi sebagai sumber protein alternatif yang berperan untuk memenuhi kebutuhan protein masyarakat (Solang, 2019).
6
Kerang darah termasuk famili Arcidae dan genus Anadara. Menurut Solang (2019), klasifikasi kerang darah adalah sebagai berikut:
Kingdom : Animalia Filum : Mollusca Kelas : Bivalvia
Subkelas : Lamelladibranchia Ordo : Arcoida
Famili : Arcidae Sub famili : Anadarinae Genus : Anadara
Spesies : Anadara granosa L
Kerang dewasa panjangnya berukuran 5 sampai 6 cm dan lebar 4 sampai 5 cm. Laju pertumbuhan 0,098 mm/hari, untuk tumbuh sepanjang 4-5 mm memerlukan waktu sekitar 6 bulan. Cangkang kerang darah tebal, oval, dan kedua sisi sama (Solang, 2019).
2.2. Protein
Protein berasal dari bahasa Yunani yaitu Protos yang memiliki arti
“paling utama”. Protein ialah makro molekul yang terdapat di dalam sel. Protein juga merupakan senyawa organik komplek yang memiliki bobot molekul yang besar. Bobot molekul tersebut terdiri dari asam amino yang berikatan dengan ikatan peptida (Sari, 2018).
Protein memiliki beberapa fungsi penting diantaranya sebagai biokatalisator (enzim), protein cadangan, biomol transfer bahan, struktur dan
7
protektif. Protein juga memiliki peran penting untuk pertumbuhan tubuh sepeti pembentukan struktur tubuh, dan regulasi sel-sel makhluk hidup termasuk virus (Sari, 2018).
Protein merupakan makromolekul yang paling melimpah di dalam sel.
Unit pembangunnya adalah asam amino yang berikatan secara kovalen untuk menghubungkan molekul-molekul menjadi rantai. Apabila protein dihidrolisis dengan asam, alkali atau enzim akan dihasilkan campuran asam-asam amino (Solang, 2019).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa beberapa spesies moluska memiliki kandungan protein sehingga dapat tetap tumbuh dan berkembang dengan baik di laut bebas. Berdasarkan Hasan (2014), ekstrak protein kepah (Atactodea striata) dinilai efektif sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
Selain itu, menurut Kusumaningtyas (2013) susu dapat digunakan menjadi peptida antimikroba, salah satunya yaitu susu kambing. Menurut penelitiannya, peptida hasil hidrolisis susu kambing dengan enzim bromelin dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Peptida didefinisikan sebagai senyawa alami yang tersusun dari beberapa monomer asam amino yang tergabung dan saling berikatan melalui ikatan peptida atau amida. Peptida dikenal sebagai bahan yang selektif dan efektif sekaligus relatif lebih aman dan dapat ditoleransi oleh tubuh karena berasal dari protein sehingga tidak dianggap sebagai benda asing sebagaimana obat kimia.
Meskipun beberapa peptida bebas sudah tersedia secara alamiah, kebanyakan peptida bioaktif masih terikat dalam protein asal dan dilepaskan melalui proses
8
enzimatik atau hidrolisis. Beberapa peptida secara biologi aktif dan berguna untuk meningkatkan status kesehatan manusia dan hewan yang biasa disebut sebagai peptida bioaktif (Kusumaningtyas, 2018).
Peptida bioaktif umumnya memiliki berat molekul yang rendah dan bersifat hidrofobik. Peptida bioaktif umumnya terdiri dari 2-20 asam amino dan banyak peptida bioaktif yang mempunyai sifat fungsinonal lebih dari satu. Asam amino tersebut dapat berasal dari tumbuhan maupun hewan seperti susu, keju, yoghurt, ikan, daging, kacang-kacangan dan kefir (Rosiana dan Amareta, 2016).
Peptida tidak berasa atau pahit kecuali peptida yang mengandung glutamat atau asam aspartat yang berasa manis. Secara nutrisi, dalam bentuk peptida akan meningkatkan bioavailabilitas asam amino dibandingkan dengan protein bahkan asam amino bebasnya. Peptida juga mempunyai berat molekul rendah sehingga kurang menimbulkan alergi dibandingkan dengan protein alamiahnya (Kusumaningtyas, 2013).
Peptida bioaktif merupakan fragmen spesifik dari protein yang mempunyai pengaruh positif terhadap beberapa fungsi dan kondisi tubuh terutama dalam hal kesehatan. Sebagian besar peptida bioaktif tersebut dapat diperoleh dari protein alamiahnya dengan cara hidrolisis enzimatik, pemecahan enzimatik oleh mikroorganisme melalui proses fermentasi atau melalui pemrosesan makanan seperti asam, basa atau pemanasan. Karakteristik peptida tersebut sangat ditentukan oleh susunan dan panjang asam amino dalam rantai peptida (Kusumaningtyas, 2013).
Bioaktif peptida yang juga dikenal sebagai ikatan amida atau peptida adalah zat organik yang terbentuk dari asam amino yang bergabung dengan
9
ikatan kovalen. Sebagian besar bioaktif peptida yang dienkripsi dalam struktur protein induk kemudian dilepaskan oleh proses enzimatik (Prastika dkk., 2019).
Peptida bioaktif dapat berasal atau diturunkan dari makanan dan memiliki fungsi baik pada manusia. Peptida bioaktif dapat ditemukan pada telur, susu, daging dan ikan. Aktivitas peptida bioaktif sebagai antimikroba, antitrombotik, antihipertensi, antioksidan dan antikolesterol dapat dipengaruhi oleh banyaknya urutan peptida (Rinto dkk., 2019).
Protein diketahui sebagai sumber bioaktif peptida yang belum aktif dalam rantai polipeptidanya dan dapat diaktifkan selama pengolahan makanan atau selama proses pencernaan (Prastika dkk., 2019).
Peptida memiliki aktifitas biologis seperti antihipertensi, antioksidatif, antitrombotik, hiperkolestrolemik (sistem kardiovaskuler), ”opioid” agonistik dan antagonistik (sistem saraf), anti selera makan, antimikroba (sistem gastrointestinal), imodulator, sitomudolator (sistem imun) (Nirmagustina dan Wirawati, 2014).
2.3. Hidrolisis Protein
Hidrolisis protein merupakan protein yang mengalami degradasi hidrolitik dengan asam, basa, atau enzim proteolitik yang menghasilkan produk berupa asam amino dan peptida. Pengunaan enzim dalam menghidrolisis protein dianggap paling aman dan menguntungkan. Hal ini disebabkan kemampuan enzim dalam menghidrolisis protein dapat menghasilkan produk hidrolisat yang terhindar dari perubahan dan kerusakan produk. Selama hidrolisis terjadi konversi protein yang bersifat tidak larut menjadi senyawa nitrogen yang bersifat larut (Kurniawan dkk., 2012).
10
Protein akan menjadi senyawa yang bioaktif apabila telah melewati proses hidrolisis, dimana proses tersebut dapat memutuskan ikatan peptida yang terdapat pada protein. Pada sisi pemotongan yang tepat, proses hidrolisis dapat mengaktifkan sifat bioaktif yang disebabkan oleh interaksi rantai samping dari asam amino. Jenis dan urutan asam amino yang berbeda dapat menghasilkan interaksi yang berbeda sehingga sifat bioaktif yang dihasilkan juga beragam.
Selain dengan enzim pencernaan, proses hidrolisis enzimatik salah satunya dapat dilakukan menggunakan enzim proteolitik (Lestari dan Giordan, 2020).
Hidrolisis secara enzimatis dapat memperkecil ukuran peptida, yang dapat merubah karakteristik dan meningkatkan kualitas protein. Hidrolisat protein menggunakan enzim proteolitik dapat memecah ikatan peptida. Protein yang dihidrolisis dengan menggunakan enzim sangat tergantung pada tipe enzim, substrat, dan kondisi hidrolisis yang meliputi pH, suhu, lama inkubasi dan konsentrasi enzim hidrolisis (Jaziri dkk., 2017).
Peptida hasil pemecahan protein akan mengalami perubahan karakteristik fisiko-kimia dari protein alamiahnya (Kusumaningtyas, 2013). Degradasi protein menjadi peptida oleh enzim akan meningkatkan aktivitas biologis yang dimiliki, dalam hal ini antibakteri. Selain itu, peptida memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga dapat lebih mudah masuk kedalam pori-pori pada membran bakteri, sehingga memiliki aktivitas antibakteri yang lebih tinggi daripada protein dengan bobot molekul yang lebih besar (Lestari dan Giordan, 2020).
Proses hidrolisis enzimatik dapat menghasilkan peptida bioaktif yang mempunyai aktivitas biologis, seperti sebagai antibakteri, antioksidan, antihipertensi, dan anti-inflamasi (Kusumaningtyas 2013).
11 2.4. Bakteri
Mikroorganisme merupakan mahkluk hidup yang berukuran sangat kecil yaitu dalam skala mikrometer atau mikron atau sepersejuta meter dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang (Nasution, 2019).
Bakteri berasal dari kata bakterion (Yunani) yang berarti tongkat atau batang. Bakteri adalah sel prokariotik yang khas, uniseluler dan tidak mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Sel- selnya secara khas berbentuk bola seperti batang atau spriral. Bakteri yang khas berdiameter sekitar 0,5-1,0 μm dan panjangnya 1,5-2,5 μm (Pelczar dkk., 1986).
2.4.1. Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, kokobasil dengan ukuran 2.4 x 0.4 -0.7 µm, memiliki flagela petritikus sehingga bersifat motil, dan tidak dapat membentuk spora (Prasetya, dkk., 2019).
Menurut Brooks dkk (2007), klasifikasi Escherichia coli adalah:
Kingdom : Prokaryotae Divisi : Gracilicutes Kelas : Scotobacteria Ordo : Eubacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
Bakteri ini termasuk flora normal manusia, namun dapat menyebabkan penyakit yang serius seperti hemolytic uremic syndrome (HUS), hemorrhagic colitis (HC), keracunan makanan, dan diare. Escherichia coli sering mengkontaminasi makanan dan minuman sehingga dijadikan sebagai indikator
12
pencemaran bakteri patogen untuk konsumsi manusia. Disamping itu, Escherichia coli juga sering sulit dalam hal pengobatan infeksinya dikarenakan kemampuannya dalam memproduksi enzim extended spectrum beta lactamase (Prasetya, dkk., 2019).
2.4.2. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif, tidak bergerak dan tidak berspora dan mampu membentuk kapsul, berbentuk kokus, dan tersusun seperti buah anggur. Ukuran Staphylococcus aureus berbeda – beda tergantung pada media pertumbuhannya (Nasution, 2019).
Menurut Nasution (2019), klasifikasi Staphylococcus aureus adalah:
Domain : Bacteria Kingdom : Prokaryotae Divisi : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Bacillales Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus patogen utama bagi manusia, hampir setiap orang akan mengalami beberapa tipe infeksi Staphylococcus aureus sepanjang hidupanya, beratnya mulai dari keracunan makanan atau infeksi kulit ringan, sampai infeksi berat yang mengamcam jiwa (Nasution, 2019).
2.5. Senyawa Antibakteri
Antibakteri adalah senyawa yang digunakan untuk mengendalikan pertumbuhan bakteri yang bersifat merugikan. Pengendalian pertumbuhan
13
mikroorganisme bertujuan untuk mencegah penyebaran penyakit/infeksi, membasmi mikroorganisme pada inang yang terinfeksi, dan mencegah pembusukan serta perusakan bahan dan mikroorganisme (Utomo, dkk., 2018).
Peptida antimikroba adalah fragmen protein berukuran kecil yang dapat membunuh atau mengganggu pertumbuhan bakteri (Lestari dan Giordan, 2020).
Peptida ini dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif maupun bakteri gram positif. Aktivitas antibakteri dari peptida dapat berbeda – beda terhadap setiap spesies (Lestari dan Soesilo, 2017).
Peptida antimikroba (antimicrobial peptides/ AMPs) biasanya tersusun dari 12-50 asam amino dan mempunyai struktur amfipatik. Peptida antimikroba biasanya bermuatan positif dan hidrofobik yang memungkinkan untuk berinteraksi dengan muatan negatif pada permukaan membran sel bakteri.
Selanjutnya, peptida menyisip dan membentuk pori yang berakibat pada kerusakan membran dan kematian sel bakteri (Kusumaningtyas, 2018).
Antimikroba dari senyawa peptida merupakan molekul kofaktor dalam sistem pertahanan tubuh dan sistem imunitas terhadap infeksi. Penggunaan antimikroba dari senyawa peptida dalam bidang pengobatan sangat potensial, karena AMP (Antimicrobial Peptide) dapat merekonstruksi sel target dan memiliki kemampuan antimikroba yang lebih kuat dibanding antibiotik biasa.
Senyawa ini dapat meregulasi sel target untuk memodifikasi struktur di luar selnya agar lebih sensitif terhadap antibiotik, 2) mengatasi resistensi, 3) bekerja secara non-kompetitif dengan antibiotik biasa (Yeaman dan Yount, 2005).
Peptida bioaktif yang memiliki sifat antimikroba melakukan aktivitas penghambatannya dengan 3 cara yaitu berinteraksi dengan membran, penetrasi
14
ke dalam membran, dan berinteraksi dengan komponen seluler yang lain (Lestari dan Giordan, 2020).
Mekanisme peptida antibakteri dalam menghambat bakteri dapat berbeda-beda. Mekanisme ini dapat dipengaruhi oleh sifat dan komposisi asam amino dari peptida dan juga jenis bakteri. Pada umumnya peptida dapat berinteraksi dengan membran bakteri, namun ada juga peptida antibakteri yang dapat melewati membran untuk masuk ke dalam sel bakteri. Interaksi peptida dengan membran bakteri dipengaruhi oleh peptida dan komponen lipid dari membran bakteri. Peptida antibakteri biasanya mengandung lebih banyak asam amino hidrofobik, namun tetap bersifat amfifatik (Lestari dan Soesilo, 2017).
2.6. Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian mikrobiolgi memanfaatkan mikroorganisne sebagai indikato pengujian. Pengujian ini diukur respon pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap agen antimikroba. Tujuan assay antimikroba (termasuk antibiotik dan substansi antimikroba nonantibiotik, misalnya fenol, bisfenol, aldehid), adalah untuk menentukan potensi dan kontrol kualitas selama proses produksi senyawa antimikroba di pabrik. Senyawa antibakteri merupakan senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas bakteri lain yang dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri) dan bakteristaltik (menghambat pertumbuhan bakteri). Dimana pada kondisi bakterisidal (membunuh bakteri) maka sekaligus bersifat bakteristaltik (menghambat pertumbuhan bakteri).
Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien (Pratiwi, 2008).
15
Ada beberapa metode pengukuran antibakteri, namun yang paling umum digunakan adalah metode dilusi dan difusi, sebagai berikut
1. Metode Difusi
Metode difusi digunakan untuk mengukur aktivitas antibakteri berdasarkan pengamatan dari diameter zona jernih yang dihasilkan pada media karena adanya agen antibakteri yang berdifusi dari tempat awal pemberian. Metode ini dilakukan dengan menempatkan agen antibakteri pada media padat yang telah diinokulasikan biakan bakteri. Ada beberapa pembagian dari metode difusi antara lain adalah :
a. Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar (Pratiwi, 2008).
b. Metode e-test untuk mengestimasi MIC yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada permukaan media Agar yang telah ditanami mikroorganisme (Pratiwi, 2008).
c. Metode ditch-plate sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji maksimum 6 macam digoreskan ke arah parit yang berisi agen antimikroba (Pratiwi, 2008).
16
d. Metode cup-plate ini serupa dengan metode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji (Pratiwi, 2008).
e. Metode gradient-plate media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan.
Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dituang di atasnya. Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji maksimal 6 macam digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah, yang perlu diperhatikan dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair, faktor difusi agen antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat (Pratiwi, 2008).
2. Metode Dilusi
Metode ini digunakan untuk menentukan Kadar Hambat Minimal (KHM), yaitu konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri, dan menentukan Kadar Bunuh Minimal (KBM), yaitu konsentrasi rendah yang dapat membunuh bakteri. Metode dilusi ini terbagi dua yaitu:
a. Metode dilusi cair/ broth dilution test mengukur KHM dan KBM, cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun 26 agen antimikroba, dan diinkubasi
17
selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).
b. Metode dilusi padat/ solid dilution test serupa dengan metode dilusi cair, namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).
18 BAB III
METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode eksperimental yang meliputi isolasi protein, hidrolisis protein dengan variasi waktu 1 jam, 3 jam, 5 jam, serta uji aktivitas antibakteri isolat dan hidrolisat protein. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Mikrobiologi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
3.1. Alat dan Bahan Penelitian 3.1.1 Alat Penelitian
Alat – alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf (Express equipment), neraca analitik, batang pengaduk, beaker glass, cawan petri, hot plate, inkubator (Memmert), jangka sorong (Electric Digital Capliper), jarum ose, Kain saring batis, Laminar Air Flow Cabinet (Astec HLF I200 L), lampu bunsen, lemari pendingin (Thermo Scientific), mikroskop (Zeiss), pinset, pipet mikro (Eppendorf), pH meter, tabung reaksi, timbangan analitik (Sartorius), oven (Memmert), pinset, saringan, sendok, spektrofotometer uv-vis, vortex (Biosan), water-bath shaker.
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah akuades, buffer A (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%), Bovine Serum Albumin (BSA), lowry A (larutan asam fosfotungstat-phospomolybdat dengan akuades 1:1), lowry B (Na2CO3 2%, NaOH 0,1 N, CuSO4.5H2O 1%, Natrium Kalium Tatrat 2%), kerang darah
19
(Anadara granosa L), Tripsin. Media yang digunakan adalah nutrient agar (Himedia), nutrient broth (Himedia), mueller hintoon agar (Himedia.) Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, stok kultur murni koleksi Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.2. Pembuatan Pereaksi 3.2.1 Buffer A
Buffer A (tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β- mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%) dibuat dengan cara menambahkan tris (Hidroksimetil) aminometana sebanyak 6,05 gram, NaCl sebanyak 58,5 gram, dan 0,555 gram CaCl2 dilarutkan dengan akuades. Ditambahkan dengan HCl sampai pH 8,3. Ditambahkan β-mercaptoetanol 1% sebanyak 15 mL triton X- 100 0,5% sebanyak 2,5 mL. Dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 500 ml, kemudian dihomogenkan (Niche dkk., 2017).
3.2.2 Lowry A
Folin Clocalteu sebanyak 2 ml ditambahkan akuades, kemudian dihomogenkan (Niche, dkk., 2017).
3.2.3 Lowry B
Na2CO3 2% dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1 N. Ditambahkan 1 mL Na-K-Tatrat 2% dan 1 mL CuSO4.5H2O 1% kemudian dihomogenkan. (Niche, dkk., 2017).
3.3. Isolasi Protein Kerang Darah
Kerang darah ditimbang sebanyak 500 gram berat segar, dihaluskan dengan 800 mL pelarut buffer A menggunakan blender, kemudian di saring
20
dengan kain saring batis. Kemudian filtrat yang diperoleh dibeku-cairkan sebanyak 2-3 kali lalu disentrifugasi pada 6000 rpm suhu 4°C selama 30 menit, selanjutnya supernatan disimpan dalam lemari pendingin sebelum dilanjutkan pengujian kadar protein ekstrak kasar protein dan proses pemurnian (Niche, dkk., 2017).
3.4. Hidrolisis Protein Kerang Darah
Sebanyak 45 mL isolat protein dimasukkan ke dalam erlenmeyer.
Ditambahkan 7,5 mL enzim tripsin 1%, (perbandingan enzim – substrat yaitu 1:
6). Diatur pH 8 dengan penambahan HCl 0,5 N. Dimasukkan ke dalam waterbath shaker pada suhu 37˚C, selama 1 jam, 3 jam , 5 jam. Dihentikan hidrolisis dengan pemanasan pada suhu 90˚C selama 15 menit (Asmi dkk, 2019).
3.5. Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry (1951), menggunakan BSA sebagai standar. Dilakukan pengenceran larutan sampel dengan cara diambil 0,5 ml, dimasukkan ke dalam labu 100 mL dan dicukupkan dengan akuades. Ke dalam vial 10 mL dimasukkan 2 mL larutan sampel yang telah diencerkan lalu ditambahkan 2,75 mL pereaksi Lowry B. Larutan campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 10-15 menit pada suhu kamar.
Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL pereaksi Lowry A, dihomogenkan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Absorbansinya kemudian diukur pada panjang gelombang maksimum (λmax). Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara mensubtitusikan absorbansi larutan ke dalam persamaaan regresi kurva kalibrasi larutan standar protein (Niche, dkk., 2017).
21 3.6. Pembuatan Media
3.6.1. Media Nutrient Agar
Komposisi : Peptone 5 g Sodium chloride 5 g HM peptone 1,5 g Yeast extract 1,5 g
Agar 15 g
Cara pembuatan :
Sebanyak 28 g nutrient agar (NA) dimasukkan kedalam Erlenmeyer tambahkan air suling 1000 mL, lalu dipanaskan sampai larut sempurna.
Kemudian disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Himedia, 2005).
3.6.2. Media Nutrient Broth
Komposisi : Peptone 5 g Sodium chloride 5 g Beef extract 1.5 g Yeast extract 1.5 g Cara pembuatan:
Sebanyak 13,0 gram serbuk nutrient broth dilarutkan kedalam 1000 mL air suling. Dipanaskan jika perlu untuk melarutkan media secara sempurna.
Kemudian disterilkan di autoklaf pada 121°C selama 15 menit (Himedia, 2005).
22 3.6.3. Media Mueller Hinton Agar
Komposisi : Beef infusion from 300 g Casein acid hydrolysate 17.5 g
Starch 1.5 g
Agar 17g
Cara pembuatan:
Sebanyak 38,0 gram serbuk Mueller Hinton Agar ditimbang, disuspensikan ke dalam 1000 ml air suling. Dipanaskan hingga sampai bahan larut sempurna lalu disterilkan di dalam autoklaf pada 121°C selama 15 menit (Himedia, 2005).
3.7. Pembuatan Larutan Uji Dengan Berbagai Konsentrasi
Larutan uji masing - masing isolat dan hidrolisat 1,3 dan 5 jam dibuat dalam berbagai konsentrasi, yaitu 100% (tanpa pengenceran), selanjutnya dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 75%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% (%v/v).
3.8. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven pada 170ºC selama 1 jam. Media pertumbuhan bakteri disterilkan di autoclaf pada 121ºC selama 15 menit. Sedangkan jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan nyala bunsen (Lay dan Sugiyo, 1994).
23 3.9. Pembiakan Bakteri
3.8.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dengan jarum ose steril, lalu diinokulasikan pada permukaan media agar miring dengan cara menggores kemudian diinkubasikan pada suhu 37˚C selama 24 jam (Nasri, 2019).
3.8.2 Pembuatan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 mL media nutrient broth (Mambang dkk., 2014). Diukur transmitan pada panjang gelombang 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-Visibel. Target nilai transmitan lebih kurang 25% pada panjang gelombang 580 nm (Depkes RI, 2020).
3.10. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar dalam 3 pengulangan. Suspensi bakteri diambil sebanyak 0,1 mL, dihomogenkan dalam cawan petri yang steril. Kemudian sebanyak 15 mL Mueller Hinton Agar cair dituang ke dalam cawan petri yang telah terisi bakteri dan homogenkan kembali sampai media memadat. Selanjutnya, media dilubangi dengan alat pelubang gabus berdiameter 6 mm. Kemudian masing – masing lubang sumur diberikan 25 µL larutan uji setiap konsentrasi menggunakan mikropipet. Media Mueller Hinton Agar yang telah diberikan perlakuan tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C tanpa dibalik. Setelah diinkubasi, hasil aktivitas antibakteri dapat diamati secara visual dengan mengukur diameter zona hambat atau zona bening di sekitar sumuran menggunakan jangka sorong (Chandra dkk., 2018). Langkah kerja penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
24 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah
Isolasi protein dilakukan terhadap 500 gram kerang darah (Anadara granosa L). Gambar kerang darah dapat dilihat pada Lampiran 2. Isolasi dilakukan menggunakan pelarut buffer A dengan perbandingan 5 : 8. Dari hasil isolasi, diperoleh isolat protein dengan total volume sebesar 575 ml
Gambar 4.1 Isolat Protein Kerang Darah (Anadara granosa L)
Setelah proses isolasi selesai, dilanjutkan dengan proses hidrolisis isolat kerang darah dengan enzim tripsin 1 % pada pH 8, 37˚C, dengan rasio enzim – substrat (1: 6) dengan variasi waktu hidrolisis (1, 3, 5 jam) dengan menggunakan waterbath shaker ( Asmi dkk., 2019). Hasil hidrolisis dapat dilihat pada Lampiran 2.
Kemudian isolat dan hidrolisat protein yang telah diperoleh dilakukan pengukuran kadar protein. Pengukuran kadar protein masing – masing larutan berdasarkan metode Lowry menggunakan BSA sebagai larutan standar.
25 4.2. Pengukuran Kadar Protein Terlarut 4.2.1. Hasil Penentuan Absorbsi Maksimum
Pada penelitian ini digunakan BSA untuk membuat kurva standar.
Panjang gelombang maksimum ditentukan agar mengetahui waktu mengetahui waktu absorpsi mencapai maksimum sehingga waktu tersebut dapat digunakan untuk meningkatkan proses absorbsi larutan Folin-Ciocalteau fenol dan dapat menghasilkan warna kebiruan (Hambal, dkk., 2016).
Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum yaitu pada 740,6 nm dengan absrobansi sebesar 0,474. Data hasil pengukuran dapat dilihat pada Gambar 4.2
Gambar4.2.Kurva Absorbsi Maksimum
4.2.2. Pengukuran Kurva Kalibrasi Larutan Standar BSA
Kurva standar BSA perlu dilakukan karena menjadi dasar penentuan konsentrasi kadar protein di dalam larutan. Sebagai kurva standar yang menghubungkan antara konsentrasi dan absorbansinya. Konsentrasi standar BSA sebelumnya didapatkan dari nilai absorban panjang gelombang maksimum BSA.
Setelah itu, pada nilai panjang gelombang 740,6 nm dapat digunakan untuk
26
mengukur konsentrasi BSA. Selanjutnya, kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang konsentrasinya belum diketahui. Kurva hasil pengukuran dapat dilihat pada Gambar 4.3. Data hasil pengukuran kurva kalibrasi dapat dilihat pada Lampiran 3.
Gambar 4.3 Hasil Pengukuran Kurva Kalibrasi BSA
4.2.3. Pengukuran Kadar Protein Terlarut
Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode Lowry. Adapun hasil pengukuran kadar protein dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil Pengukuran Kadar Protein Kerang Darah (Anadara granosa L)
No Sampel Larutan Uji Absorbansi Konsentrasi
Konsentrasi protein (mg/ml)
1 Isolat Protein 0,4901 0,0618 32,445
2 H1 0,5232 0,0660 34,65
3 H3 0,5500 0,0694 36,435
4 H5 0,5954 0,0752 39,48
Keterangan : H1 :Hidrolisat 1 jam H3 :Hidrolisat 3 jam H5 :Hidrolisat 5 jam
Hasil pengukuran kadar protein pada Tabel 4.1 menunjukkan bahwa konsentrasi protein tertinggi pada hidrolisat 5 jam yaitu 39,48 mg/ml dan
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1
I
Konsentrasi (mg/ml)
Absorbans
Y = 7,8902X + 0,0020 R2= 0,9989
27
konsentrasi protein terendah pada isolat protein yaitu 32,445 mg/ml. Perhitungan kadar protein dapat dilihat pada Lampiran 4.
Peningkatan kadar protein terlarut tersebut disebabkan oleh adanya aktivitas enzim protease. Enzim ini memecah protein kompleks menjadi protein yang lebih sederhana dengan cara memutuskan ikatan – ikatan peptida dalam protein. Pemutusan tersebut menyebabkan protein berisfat mudah larut, sehingga kadar protein terlarutnya meningkat (Arianingrum, dkk., 2007).
Pada metode Lowry, reaksi yang terlibat adalah kompleks Cu (II) – Protein, yang dalam suasana alkalis akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin Ciocalteu, kompleks phosphomolybdat–
phospotungstate, yang memberikan warna biru (Rahmawati, dkk., 2019).
4.3. Aktivitas Antibakteri Protein Kerang Darah
Uji aktivitas antibakteri protein dilakukan terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan menggunakan metode difusi agar. Hasil pengukuran aktivitas antibakteri isolat dan hidrolisat protein terhadap Escherichia coli dapat dilihat pada tabel 4.2
Tabel 4.2 Hasil Uji Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah Terhadap Escherichia coli
Konsentrasi (%v/v)
Diameter Daerah Hambat
Isolat Protein H1 H3 H5
D* (mm) ± SD
D* (mm) ± SD
D* (mm) ± SD
D* (mm) ± SD 100 10,43 ± 0,12 10,53 ± 0,08 11,90 ± 0,10 12,23 ± 0,12
75 7,47 ± 0,32 8,43 ± 0,47 10,40 ± 0,10 10,70 ± 0,26 50 6,77 ± 0,15 6,67 ± 0,21 8,80 ± 0,26 9,03 ± 0,15
25 - - 6,83 ± 0,12 6,90 ± 0,10
12,5 - - - -
K(-) - - - -
Keterangan : H1 :Hidrolisat 1 jam H5 :Hidrolisat 5 jam H3 :Hidrolisat 3 jam
28
Berdasarkan hasil pengukuran aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli diperoleh konsentrasi hambat minimun (KHM) pada isolat protein kerang darah yaitu 50%, pada hidrolisat 1 jam yaitu 50% , pada hidrolisat 3 jam yaitu 25% dan pada hidrolisat 5 jam yaitu 25%.
Tabel 4.3 Hasil Uji Antibakteri Isolat dan Hidrolisat Protein Terhadap Staphylococcus aureus
Konsentrasi (%v/v)
Diameter Daerah Hambat
Isolat Protein H1 H3 H5
D* (mm) ± SD
D* (mm) ± SD
D* (mm) ± SD
D* (mm) ± SD 100 10,67 ± 0,12 10,83 ± 0,15 13,23 ± 0,15 14,03 ± 0,15
75 8,67 ± 0,15 8,83 ± 0,06 11,00 ± 0,30 12,17 ± 0,23 50 7,00 ± 0,10 7,43 ± 0,15 9,53 ± 0,25 10,23 ± 0,25
25 - - 6,97 ± 0,38 7,60 ± 0,26
12,5 - - - -
K(-) - - - -
Keterangan : H1 :Hidrolisat 1 jam H3 :Hidrolisat 3 jam H5 :Hidrolisat 5 jam
Berdasarkan hasil pengukuran aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus diperoleh konsentrasi hambat minimun (KHM) pada isolat protein kerang darah yaitu 50%, pada hidrolisat 1 jam yaitu 50% , pada hidrolisat 3 jam yaitu 25% dan pada hidrolisat 5 jam yaitu 50%. Hasil pengukuran zona bening dapat dilihat pada Lampiran 5 – 6.
Hidrolisis protein adalah proses penguraian protein menjadi senyawa - senyawa yang lebih sederhana (asam-asam amino) baik oleh enzim, basa maupun asam. Hidrolisis secara enzimatis dapat memperkecil ukuran peptida, yang dapat merubah karakteristik dan meningkatkan kualitas protein (Jaziri dkk., 2017). Hidrolisis secara enzimatis dapat meningkatkan aktivitas antibakteri dan antioksidan (Wang, dkk., 2020).
29
Protein akan menjadi senyawa yang bioaktif apabila telah melewati proses hidrolisis, dimana proses tersebut dapat memutuskan ikatan peptida yang terdapat pada protein. Pada sisi pemotongan yang tepat, proses hidrolisis dapat mengaktifkan sifat bioaktif yang disebabkan oleh interaksi rantai samping dari asam amino. Degradasi protein menjadi peptida oleh enzim akan meningkatkan aktivitas biologis yang dimiliki, dalam hal ini antibakteri. Selain itu, peptida memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga dapat lebih mudah masuk kedalam pori-pori pada membran bakteri, sehingga memiliki aktivitas antibakteri yang lebih tinggi daripada protein dengan bobot molekul yang lebih besar (Lestari dan Giordan, 2020).
Peptida antibakteri berinteraksi dengan membran sel bakteri melalui interaksi muatan positif peptida dengan muatan negatif pada permukaan sel bakteri. Mekanisme selanjutnya tergantung pada tipe peptida. Secara umum dapat dipisahkan peptida yang bekerja dengan mempengaruhi permeabilitas membran dan peptida yang bekerja di sitoplasma. Peptida yang bekerja dengan mempengaruhi membran permeabilitas membran dapat terjadi dengan cara membuat pori. Mekanisme lain adalah peptida antibakteri masuk ke dalam sitoplasma dan menghambat fungsi intraseluler seperti menghambat sintesis DNA, RNA, dan reaksi enzimatis tanpa menganggu stabilitas membran (Kusumaningtyas, dkk., 2015).
Mekanisme kerja PAM (Peptida Antimikroba) yaitu dengan cara mengganggu metabolisme dan menghancurkan membran mikroba. Interaksi antara PAM dengan mikroba bersifat elektrostatik, yaitu terjadi interaksi antara PAM yang bersifat kationik dengan komponen bakteri, jamur, atau virus yang bersifat anionik . Komposisi asam amino dan muatan kation memudahkan PAM
30
untuk menempel dan masuk ke dalam sel melalui celah yang telah terbentuk pada membran. Bagian terluar lapisan membran bakteri, sebagian besar mengandung lipid bermuatan negatif. PAM akan menempel di bagian terluar membran mikroba. Integrasi PAM pada membran menyebabkan permukaan luar membran menipis, selanjutnya terjadi peregangan pada lapisan bilayer.
Kemudian terbentuk celah yang bersifat sementara pada fase transisi. Lipid dan PAM bergerak menuju bagian dalam membran. Difusi PAM menuju target intraselular. Membran sel target akan rusak membentuk fragmen-fragmen (Gunawan, dkk., 2019).
Gugus hidroksil senyawa fenol (OH) berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri dalam menghambat bakteri. Fenol dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan merusak permeabilitas membran. Senyawa fenol bekerja pada membran sel dengan cara merusak lapisan fosfolipid pada membran. Gugus – OH pada fenol akan berikatan dengan sisi polar pada lapisan tersebut, sehingga menyebabkan gangguan dan mengurangi permeabilitas lapisan tersebut.
Kerusakan membran ini akan memungkinkan ion organik, nukleotida, koenzim dan asam amino ikut keluar sel. Hal ini akan mengganggu pertumbuhan bakteri, bahkan bisa menyebabkan kematian (Iryani, dkk., 2013).
Tabel 4.4 Hasil Uji Antibakteri Antibiotik Amoxicillin Trihydrate Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
Konsentrasi (mg/ml)
Diameter Daerah Hambat
Escherichia coli Staphylococcus aureus D* (mm) ± SD D* (mm) ± SD
0,25 15,47 ± 0,40 15,73 ± 0,55
K(-) - -
Gambar hasil uji aktivitas Amoxicillin Trihydrate Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dapat dilihat pada Lampiran 7.
31
Klasifikasi daya hambat pertumbuhan bakteri mengikuti Greenwood dibagi menjadi kuat yaitu >20 mm, sedang yaitu 16 – 20 mm, lemah yaitu 10 – 15 mm dan tidak ada yaitu <10 (Milah, dkk., 2016).
Aktivitas zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroorganisme tergantung pada konsentrasi dan jenis bahan antimikroba tersebut. Hal ini dapat buktikan dengan melihat data hasil penelitian ini, bahwa semakin besar konsentrasi sampel semakin besar daya hambat nya.
Hal ini sesuai dengan Rahmawati (2014) bahwa semakin besar konsentrasi sampel yang maka semakin besar pula diameter daya hambat yang terbentuk, karena semakin banyak komponen bioaktif yang terkandung didalam sampel.
Dari penelitian diperoleh bahwa isolat dan hidrolisat protein memiliki aktivitas antibakteri yang lebih tinggi pada Staphylococcus aureus dibandingkan dengan Escherichia coli, dilihat dari zona hambat seperti yang tertera pada tabel 4.2 dan tabel 4.3.
Hal ini disebabkan karena struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antibakteri untuk masuk ke dalam sel dan mencari target kerjanya, sedangkan struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks dan berlapis tiga yaitu lapisan luar lipoprotein. , lapisan tengah peptidoglikan dan lapisan dalam lipopolisakarida (Sugrani, dkk., 2019).
32 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan : a. Hasil pengujian kadar protein terlarut menunjukkan bahwa kerang darah
mengandung protein bioaktif dengan konsentrasi protein pada isolat yaitu 32,445 mg/ml, hidrolisat 1 jam yaitu 34,65 mg/ml, hidrolisat 3 jam yaitu 36,435 mg/ml, dan pada hidrolisat 5 jam yaitu 39,48 mg/ml.
b. Hasil pengujian aktivitas antibakteri tertinggi terdapat pada hidrolisat 5 jam terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus masing – masing sebesar 12,23 ± 0,12 mm dan 14,03 ± 0,15 mm pada konsentrasi 100%.
Dengan konsentrasi hambat minimum pada isolat yaitu 50%, pada hidrolisat 1 jam yaitu 50%, hidrolisat 3 jam yaitu 25% dan pada hidrolisat 5 jam yaitu 25% terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
5.2. Saran
Diharapkan pada peneliti selanjutnya untuk dapat melakukan pemeriksaan peptida (sekuensing peptida) yang terkandung dalam hidrolisat kerang darah (Anadara granosa L)
33
DAFTAR PUSTAKA
Arianingum, R., Sulistyowati, E., Slirawati, D. 2007. Pengaruh Lama Fermentasi Tempe Kedelai Terhadap Aktivitas Tripsin. Jurnal Peneltiian Saintek.
12(2): 184.
Asmi, N., Ahmad.A., Massi., M.N., Natsir, H. 2019. The Potency of Protein Hydrolysate from Epiphytic Bacteria Associated With Brown Algae Sargassum sp. as Anticancer Agents. Journal of Physics. Halaman: 2.
Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. 2007. Medical Microbiology. USA : McGraw-Hill Companies. Halaman: 43.
Chandra, R.A., Yunita, R., Wahyuni, D.D., dan Anggraini, D.R. 2018. Daya Antibakteri Ekstrak Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi Linn) Terhadap Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, Esscence of Scientific Medical Journal. Halaman : 44.
Depkes RI. 2020. Farmakope Indonesia. Edisi VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 1868.
Dewiningsih, K., Widowati, I., Setyati, W.A. 2017. Skrining Aktivitas Antibakteri Pada Ekstrak Metanol Jaringan Lunak Kerang Darah (Anadara granosa L) Terhadap Bakteri Vibrio harveyi. Jurnal Enggano.
2(2): 229.
Gunawan, H., Rendy. R.M., Effendi, A. 2019. Peptida Antimikrobial. MDVI.
45(1): 55.
Hambal, M., Darmawi., Nurmayasari., Balqis, U., Ferasyi, T.R., Aisyah, S.
2016. Konsentrasi Protein Antigen Ekskretori/ Sekretori Dan Somatik Pada Fasciola gigantica dan Eurytrema pancreaticum.Jurnal Medica Veterinaria.10(2). Halaman: 129.
Hasan, T., Patong, A.R., Wahab, A.W., Djide, M.N. 2014. Isolasi dan Implementasi Protein Bioaktif Kepah (Atactodea striata) Sebagai Bahan Obat Antibakteri. Jurnal Al-Kimia. 2(2): 53.
Himedia Laboratories. 2005. Technical Data. Pvt. Limited, 23 Vadhani Industrial Estate, LBS Marg, Mumbai-86, MS, India.
www.himedialabs.com
Iryani., Suyelita., Putri, D.K. 2013. Uji Daya Hambat Asap Cair Sabut Pinang terhadap Pertumbuhan Bakteri Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa. Chemistry Journal of State University of Padang. 2(1): 41.
Jaziri, A.A., Sukoso, Firdaus, M. 2017. Karakteristik Protease Dari Ekstrak Kasar Khamir Laut dan Aktivitasnya Dalam Menghidrolisis Protein Ikan Rucah. Journal of Fisheries and Marine Science. 1(2) : 78 – 87.
Kurniawan, Lestari, S., Hanggita, S. 2012. Hidrolisis Protein Tinta Cumi – Cumi (Loligo sp) Dengan Enzim Papain. Fishtech. 1(1) : 41 –42.
Kusumaningtyas, E. 2013. Peran Peptida Susu Sebagai Antimikroba Untuk Meningkatkan Kesehatan. Wartazoa. 23 (2): 64.
Kusumaningtyas, E. 2018. Aplikasi Peptida Untuk Meningkatkan Kesehatan dan Produktivitas Ternak. Wartazoa. 28(2): 89 – 98.
Lay, B.W., Sugiyo, H. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT.
Raja Grafindo Persada. Halaman 34, 72, 73.
34
Lestari, D., Giordan, E. 2020. Peptida Bioaktif Kasein Susu Kambing sebagai Agen Antibakteri terhadap Staphylococcus aureus. Jurnal Agroindustri Halal. 6(1): 29.
Lestari, D., Soesilo, V.V. 2017. Aktivitas Antibakteri Peptida Kasein Susu Kambing Hidrolisis Oleh Papain Terhadap Pseudomonas aeruginosa.
Jurnal Ilmu Pangan dan Hasil Pertanian. 1(2): 82.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951. Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent. The Journal Of Biological Chemistry. Halaman: 265 – 274.
Mambang, D.E.P., Rosidah, dan Suryanto. 2014. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Tempe Terhadap Bakteri Bacillus subtillis dan Staphylococcus aureus.
Jurnal Teknologi dan Industri Pangan.25(1):116.
Milah, N., Bintari, S.H., Mustikaningtyas, D. 2016. Pengaruh Konsentrasi Antibakteri Propolis Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus pyogenes secara In Vitro. 5(2): 97.
Nasri. 2019. Uji Aktivitas Antibakteri Probiotik Dari Ikan Nantura Hasil Fermentasi Ikan Mas (Cryprinus carpio L.) Terhadap Salmonellla typhi.
Skripsi. Medan: Universitas Sumatera Utara. Halaman: 25.
Nasution, M. 2019. Komunitas Bakteri. Medan : USU Press. Halaman : 26.
Niche, D. 2017. Isolasi, Pemurnian dan Identifikasi Protein Bioaktif Dari Kerang Darah (Anadara granosa L.) Sebagai Antioksidan. Skripsi. Makassar : Universitas Hassanudin. Halaman: 25 – 27.
Niche, D., Ahmad, A., Ferial E.W. 2017. Isolasi, Pemurnian dan Identifikasi Protein Bioaktif Dari Kerang Darah (Anadara granosa L.) Sebagai Antioksidan. Makassar : Universitas Hassanudin. Halaman: 1.
Nirmagustina, D.E., Wirawati, C.U. 2014. Potensi Susu Kedelai Asam (Soygurt) Kaya Bioaktif Peptida Sebagai Antimikroba. Jurnal Penelitian Pertanian Terapan. 14(3) : 158 – 165.
Nurjanah, Zulhamsyah, Kustiyariyah. 2005. Kandungan mineral dan proksimat kerang darah (Anadara granosa L) yang diambil dari kabupaten boalemo, gorontalo. Buletin Teknologi Hasil Perikanan. 8(2):1-4
Pelczar Jr, M.J., Chan, E.C.S. 1986. Elements of Microbiology. Penerjemah:
Hadioetomo, R. S., Imas, T., Tjitrosomo, S. S., dan Angka, S. L. 2013.
Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI PRESS. Halaman 12-15.
Prasetya, Y.A., Winarsih, I.Y., Pratiwi, K.A., Hartono, M.C., Rochimah, D.N.
2019. Deteksi Fenotipik Escherichia coli Penghasil Extended Spectrum Beta-Lactamaskrises (ESBLS) Pada Sampel Makanan Di Krian Sidoarjo.
Life Science. 8(1): 76.
Prastika, H.H., Ratnayani, K., Puspawati, N.M., Laksmiwati, A.A.I.A.M. 2019.
Pengunaan Enzim Pepsin Untuk Produksi Hidrolisat Protein Kacang Gude (Cajanus cajan (L.) Millsp.) Yang Aktif Antioksidan. Cakra Kimia.
7(2): 180 – 188.
Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Penerbit Erlangga.
Halaman 135-141, 187-190.
Rahmawati. 2014. Interaksi Ekstrak Daun Lidah Buaya (Aloe vera L.) dan Daun Sirih (Piper betle l.) terhadap Daya Hambat Staphylococcus aureus Secara In vitro. Jurnal EduBio Tropika. 2 (1): 121-186.
