III. BAHAN DAN METODE
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Penyediaan Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan adalah Aeromonas hydrophila. Bakteri tersebut disuntikkan secara intramuskuler pada tiga ekor ikan lele untuk menguji virulensinya. Setelah itu dilakukan reisolasi bakteri dengan menggoreskan jarum ose ke bagian ginjal kemudian dibiakkan di media TSA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Koloni bakteri tunggal yang tumbuh, diisolasi di media TSA dengan teknik empat kuadran kemudian diinkubasi selama 24 jam. Untuk mendapatkan biakan murni maka setiap koloni bakteri yang tumbuh terpisah dan berlainan morfologinya diisolasi kembali ke dalam media TSA miring dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Karakterisasi yang dilakukan meliputi pengamatan morfologi koloni secara visual, meliputi warna, elevasi dan tepian sel. Uji yang dilakukan meliputi pewarnaan Gram, uji motilitas, uji oksidase dan fermentase, uji katalase, uji oksidase dan uji gelatinase. Identifikasi yang digunakan berdasarkan Bergey’s Mannual of Determination
3.3.2 Regenerasi Bakteri Uji
Bakteri yang diuji diregenerasi terlebih dahulu sebelum digunakan. Bakteri stok dari kultur primer dibiakkan dalam agar miring yaitu sebanyak satu ose digoreskan ke agar miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC. Sebanyak satu ose bakteri diambil dari biakan terbaru berumur 24-48 jam dan diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 25 ml media LB, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 27oC pada
water shaker.
3.3.3 Uji LD50
Penentuan tingkat virulensi bakteri dilakukan dengan menghitung nilai LD50 nya.
Hal ini penting untuk mengetahui konsentrasi bakteri yang digunakan. Untuk uji LD50
digunakan akuarium yang disusun untuk empat perlakuan. Masing-masing dengan kepadatan 105 sampai 109 cfu/ml secara intramuskuler sebanyak 0,1 ml/ekor pada seluruh ikan sesuai dengan label kepadatan bekteri pada setiap akuarium. Pengamatan dilakukan dengan label mengamati jumlah ikan yang masih hidup dan mati sampai hari ke tujuh. Kemudian dilakukan perhitungan untuk mengetahui nilai LD50 yaitu konsentrasi pada saat
3.3.4 Penyediaan Bahan dan Ekstrak
Proses penyediaan daun meniran adalah sebagai berikut : Daun meniran dibersihkan dari kotoran
Daun meniran dikeringkan di udara terbuka tanpa terkena sinar matahari (Harbone, 1987 dalam Ayuningtyas, 2008).
Daun meniran diblender
Diayak dengan saringan halus
Bubuk daun meniran
Sedangkan untuk bawang putih adalah sebagai berikut : Bawang putih dibersihkan dari kulitnya
Bawang putih diiris tipis
Bawang putih dikeringkan di udara terbuka tanpa terkena sinar matahari (± 3 hari)
Bawang putih dioven (suhu 60oC, ± 1 jam)
Bawang putih diblender
Diayak dengan saringan halus
Bubuk bawang putih
Berdasarkan penelitian Ayuningtyas (2008), dosis daun meniran yang efektif untuk pencegahan adalah 5 ppt dan untuk pengobatan adalah 10 ppt. Cara pembuatannya yaitu sebagai berikut, untuk pencegahan bubuk daun meniran sebanyak 50 g dilarutkan dengan akuades steril sebanyak 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi 5 mg/ml sedangkan untuk pengobatan bubuk daun meniran sebanyak 100 mg dilarutkan dengan akuades steril sebanyak 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi 10 mg/ml. Campuran antara bubuk
meniran dan akuades tersebut direbus pada suhu 90oC selama 30 menit (Sopiana, 2005). Ekstrak tersebut kemudian divortex supaya homogen dan disaring dengan kertas Whatmann.
Dosis bawang putih yang efektif untuk pencegahan adalah 20 ppt dan untuk pengobatan adalah 40 ppt. Cara pembuatan larutan, untuk pencegahan adalah dengan melarutkan bubuk bawang putih sebanyak 200 mg kedalam akuades steril sebanyak 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi 20 mg/ml sedangkan untuk pengobatan adalah dengan melarutkan bubuk bawang putih sebanyak 400 mg kedalam akuades steril sebanyak 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi 40 mg/ml. Ekstrak tersebut kemudian divortex supaya homogen disaring dengan kertas Whatman.
3.3.5 Persiapan Wadah dan Ikan Uji
Akuarium dicuci dengan sabun dan dibilas serta diisi air. Kemudian dimasukkan larutan klorin 100 ppm ke dalam akuarium dan diaerasi kuat selama 24 jam. Setelah itu dibilas lagi dengan air. Akuarium dilengkapi dengan penutup yang terbuat dari kain kasa agar ikan tidak melompat ke luar serta ditutup dengan plastik hitam di sekeliling akuarium agar ikan tidak stres. Tiap akuarium diisi 6 ekor ikan uji.
Ikan uji yang akan digunakan memiliki panjang 11-13 cm. Mula-mula ikan direndam dengan konsentrasi 30 ppm larutan garam selama 5 menit untuk menghilangkan ektoparasit. Setelah itu ikan diaklimatisasi terlebih dahulu agar ikan terbiasa hidup dalam akuarium uji selama 3 hari dengan pemberian pakan berupa pelet apung berkadar protein 28%. Jumlah pakan yang diberikan sebanyak 3% dari berat badan ikan per hari dengan frekuensi pemberian 2x sehari pada pagi dan sore hari.
3.3.6 Penyediaan Pelet Uji
Pelet yang diberikan ditimbang terlebih dahulu sesuai dengan biomassa masing- masing ikan yang berada dalam akuarium. FR yang digunakan adalah 3% dari biomassa. Rumus yang digunakan :
Biomassa = Nt Wt
Jumlah pakan = FR Biomassa
Keterangan : Nt = Jumlah ikan (ekor) Wt = Berat rata-rata (gram)
Jumlah ekstrak yang diberikan, yaitu meniran : bawang putih = 1 : 2, sedangkan jumlah ekstrak daun meniran dan bawang putih yang dicampur ke pakan adalah 0,1 ml/g
pakan. Setelah ekstrak tercampur dengan pakan, pelet dibalut dengan putih telur sebagai perekat, kemudian diangin-anginkan sebelum diberikan ke ikan.
3.3.7 Uji In Vivo
Pengujian in vivo dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak meniran dan bawang putih lewat pakan terhadap respon kekebalan tubuh ikan lele setelah diinfeksi A. hydrophila. Dari uji ini dapat dilihat potensi meniran dan bawang putih sebagai imunostimulan. Perlakuan yang diberikan berupa :
1. Kontrol negatif : disuntik dengan PBS pada hari ke-8
2. Kontrol positif : disuntik bakteri A. hydrophila sebanyak 0,1 ml/ekor pada hari ke-8
3. Perlakuan pencegahan : diberikan pakan uji seminggu sebelum disuntik bakteri
A. hydrophila sebanyak 0,1 ml/ekor pada hari ke-8
4. Perlakuan pengobatan : disuntik bakteri A. hydrophila sebanyak 0,1 ml/ekor pada hari ke-8, diberikan pakan uji pada hari ke-10 sampai hari ke-17
Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak empat kali ulangan dan diamati selama 9 hari setelah uji tantang dengan parameter yang diamati meliputi respon makan ikan, pertambahan bobot, kematian ikan uji, gejala klinis dan pengamatan organ dalam.
Pemberian pakan uji Injeksi A. hydrophila
Pencegahan
0 8 17
Injeksi A. hydrophila Pemberian pakan uji
Pengobatan 0 8 10 17 Injeksi A. hydrophila Kontrol Positif 0 8 17 Injeksi PBS Kontrol Negatif 0 8 17
Gambar 4. Skema metode penelitian (uji in vivo)
3.4 Parameter Yang Diamati
