Bioremediation and Biodegradation.4:2.
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai dari bulan April sampai dengan November 2016 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan. Analisis residu karbofuran secara kuantitatif dilakukan di Balai Besar Proteksi dan Perbenihan Tanaman Perkebunan (BBPPTP), Medan dan Pengamatan mikroskopis menggunakan SEM dilakukan di Pusat Penelitian Biologi, Bagian Zoologi, Lembaga Penelitian Indonesia, Cibinong, Jawa Barat.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain spektrofotometer, Hight Performance Liquid Chromatographi (HPLC), vortex, sentrifuge, inkubator, pipet volume, cawan petri, erlenmeyer, gelas ukur, beaker glass, jarum ose bengkok, pipet mikro dan tip, magnetic stirrer, magnetic bar, laminar airflow, ion coater, vacum drier, orbital shaker, ultrasonic cleaner dan Scanning Electron Microscope (SEM).
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain pestisida berbahan aktif karbofuran dengan merek dagang Gemafur© 3GR, Nutrient Agar (NA), Plate Count Agar (PCA), akuades, Phospat Buffered Saline (PBS), N-heksan, alkohol (50%, 70%, 85%, 95%, absolut), tert butanol, desinfektan, larutan tri- sodium sitrat, larutan polyurethane A dan B, caccodylate buffer, Glutaraldehyde 2,5%, tannic acid 2%, OsO4
Media yang digunakan pada penilitan ini adalah Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Plate Count Agar (PCA) dan Busnel Hass Broth (BHB). Bakteri yang digunakan merupakan bakteri koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU dengan spesies Pseudomonas aeruginosa dan Pseudonomonas
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Persiapan Kultur Bakteri dan Pemeriksaan Kemurnian Kultur
Kedua bakteri diremajakan pada media NA selama 1 x 24 jam. Pemeriksaan kemurnian kultur dilakukan untuk memastikan kemurnian kultur yang didapatkan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopis dengan metode pewarnaangram (Fardiaz, 1992) dan uji biokimia (Hadioetomo, 1990).Selanjutnya isolat ditumbuhkan kembali pada media NB sebagai kultur antara dalam pemanenan sel, inkubasi dilakukan dengan menggunakan orbitalshaker pada suhu ambient dengan kecepatan 120 rpm selama 2 x24 jam (Lampiran 1).
3.3.2.Pembuatan Suspensi Sel Bakteri
Isolat yang ditumbuhkan pada media NB (Nutrient Broth) sebagai kultur antara diendapkan dengan menggunakan centrifuge dengan kecepatan 6000xg selama 20 menit pada 4oC. Akan terbentuk dua fase yaitu fase cair/ supernatan (bagian atas) dan fase padat/ pelet (bagian bawah). Pelet bakteri dihomogenkan pada PBS pH 7 kemudian diendapkan dengan cara yang sama. Perlakuan ini diulangi sebanyak dua kali untuk membersihkan sel bakteri dari sisa media. Bagian pelet diambil kembali dan kemudian dicampur dengan PBS hingga homogen. Suspensi diatur kekeruhannya dengan nilai absorbansi 1 pada panjang gelombang 600 nm (109 CFU/ ml).
3.3.3.Imobilisasi Bakteri
a. Imobilisasi dengan Mengunakan Polyurethane foam (PUF)
PUF dibentuk dengan cara mencampur larutan polyurethane A dan B dengan perbandingan 1 : 1 secara aseptis pada sebuah wadah steril. Campuran dihomogenkan dengan cara diadur hingga membentuk busa. Busa dibiarkan hingga mengembang dan mengeras. Setelah busa mengeras selanjutnya dipotong hingga berukuran 50 mm x 50 mm x 50 mm. Selanjutnya dimasukkan 2 gr PUF ke dalam erlenmeyer 250 ml, disterilisasi pada autoclaft dengan suhu 121 o
16
C selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi selesai, suspensi bakteri dimasukkan
sebanyak 100 ml ke dalam erlenmeyer yang berisi PUF secara aseptis, kemudian dihomogenkan pada orbital shaker selama 6 jam (Quek et al., 2005) dimodifikasi. b. Imobilisasi dengan Menggunakan Alginat
Sebanyak 50 ml suspensi bakteri yang sama kemudian dicampurkan dengan 50 ml alginat dengan konsentrasi 3% (b/v). Selanjutnya campuran tersebut diteteskan pada CaCl2 0,1 Menggunakan syringe sambil dilakukan pengadukan
dengan kecepatan putaran 50-100 rpm menggunakan magnetic stirrer. Pengerasan gel dilakukan selama satu jam (Li et al. 2009). Gel yang terbentuk dipindahkan dalam larutan NaCl fisiologis (0,85%) untuk mendapatkan struktur gel yang kompak. Kapsul yang terbentuk selanjutnya dimasukkan ke air destilasi steril dan diputar secara perlahan selama satu jam untuk menghilangkan residu CaCl2
(Lampiran 1).
3.3.4. Efektifitas Imobilisasi
Keberhasilan dari proses imobilisasi dapat dihitung dengan cara membandingkan jumlah bakteri sebelum dan sesudah imobilisasi, dengan persamaan sebagai berikut:
����������������������= �������� ������� ������ ℎ�����������
�������� ������� ������� ����������� � 100%
3.3.5. Uji Viabilitas Bakteri Setelah Imobilisasi dan Pengaplikasian pada Media Uji
Uji viabilitas dilakukan dengan metode Triana et al. (2006) yang telah dimodifikasi, segera setelah proses enkapsulasi selesai dan diinkubasi selama 20 hari pada suhu 37o
Penghitungan jumlah bakteri segera dilakukan setelah enkapsulasi. Jumlah populasi bakteri yang terdapat pada polyurethane foam (PUF) dan kapsul alginat dihitung selama 15 hari masa inkunasi dengan interval 5 hari. Penghitungan jumlah bakteri dilakukan dengan cara memisahkan bakteri dari bahan penyalut. Kapsul alginat diguncang dalam larutan tri-sodiun sitrat hingga larut sempurna, C kondisi kering dan amobil. Viabilitas sel terenkapsulasi dihitung dengan menggunakan metode Total Plate Count menggunakan media Plate Count Agar (PCA) dengan membuat pengenceran berseri.
Efektifitas Imobilisasi = Populasi bakteri setelah imobilisasi
0,85% dan diguncang dengan vortex. Ketahanan bakteri terimobilisasi didapat dengan membandingkan populasi bakteri sebelum diaplikasikan, dengan seusdah diaplikasikan selama 15 hari masa inkubasi pada suhu ambien.
Ketahanan (%) = �������� ������� ���� �������� ���� ����� �
�������� ����������� �������� ������� �������������
× 100%
3.3.6. Uji Aktifitas Biosurfaktan
Skrining aktivitas biosurfaktan dilakukan dengan metode Drop Collapsing Test (Jain et al., 1991) yang dimodifikasi, yaitu metode yang digunakan untuk menentukan penurunan tegangan permukaan cairan. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media BHB yang ditambahkan 2% dekstrosa sebagai sumber karbon. Sebanyak 2 ml inokulum cair isolat bakteri (λ600 = 1 Abs setara 109 CFU/ml) diinokulasikan kedalam 100 ml media BHB yang mengandung 2% dekstros secara aseptis. Media diinkubasi pada waterbath shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 15 hari. Setelah 15 hari masa inkubasi, masing- masing media biakan disaring dan diambil filtratnya. Sebanyak 4 ml filtrat media dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 4 ml N-heksan dan 2 ml akuades. Lalu campuran larutan tersebut dihomogenkan dengan vorteks selama 10 detik dan didiamkan selama 1menit. Emulsi yang terbentuk diukur ketebalannya dengan menggunakan gelas ukur. Persentase Indeks Emulsifikasi (IE) dihitung dari masing-masing isolat dengan cara membandingkannya antara volume emulsi dibagi dengan totalvolume filtrat lalu dikali 100% (Hamzah et al., 2013).
IE (%)
=
������ ������ ���� �������������� ������ ������� (10 ��)
× 100%
(Hamzah et al., 2013)3.3.7. Uji Kemampuan Bakteri Terimobilisasi Dalam Mendegradasi Pestisida Secara In-vitro
Pengujian kemampuan bakteri yang telah diimobilisasi dalam mendegradasi pestisida dilakukan dengan memberikan bakteri imobil pada media cair Busnel Hass Broth dengan 4% (b/v) pestisida berbahan aktif karbofuran.
Populasi bakteri pada penyalut pada waktu t
Populasi bakteri pada penyalut sebelum diaplikasikan x 100%
Volume emulsi yang terbentuk
Total volume larutan (10 ml) x 100%
Bakteri yang telah diimobilisasi dengan menggunakan polyurethane foam maupun alginat dimasukkan masing-masing 0,2 gram dan 2 gram dalam 98 ml media uji kemudian dinkubasi pada suhu ruang selama 30 hari menggunakan orbital shaker pada suhu ruang (28oC) dengan kecepatan 100 rpm. Sebagai kontrol, dilakukan pengujian degradasi pestisida menggunakan bakteri sel bebas dengan memberikan 2 ml suspensi bakteri (λ600 = 1Abs setara 109 CFU/ml) pada 98 ml media uji. Dilakukan perhitungan jumlah sel dananalisis dengan HPLC untuk mengetahui residu pestisida pada media uji setiap 10 hari masa inkubasi selama 30 hari Teraakun et al. (2004) dimodifikasi. (Lampiran 1).
3.3.8. Pengamatan Distribusi dan Penempelan Bakteri Pada Bahan Penyalut Prosedur pengamatan mikroskopis menggunakan SEM merujuk pada Scneider (2014) yang telah dimodifikasi. Sampel berupa kapsul alginat dan polyurethane foam dibersihkan dengan cara merendam sampel dalam larutan caccodylate buffer kurang lebih 2 jam. Kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner selama 5 menit. Sampel kemudian diprefiksasi dengan merendam dalam larutan glutaraldehyde 2,5% selama 2 hari. Selanjutnya sampel difiksasi dalam tannic acid 2% selama 6 jam. Setalah itu cuci dengan caccodylate buffer selama 5 menit sebanyak 4 kali ulangan. Proses berikutnya dalah dehidrasi dengan perendaman pada alkohol 50% selama 5 menit 4 kali pengulangan, 70% selama 20 menit, 80% selama 20 menit, alkohol 95% selama 20 menit dan terakhir pada alkohol absolut selama 10 menit hingga 2 kali ulangan. Setelah proses dehidrasi selesai sampel dikeringkan dengan merendam dalam tert butanol selama 10 menit sebanyak 2 kali pengulangan. Sampel dibekukan dalam freezer sampai beku. Selanjutnya divakum dalam vacum drier hingga mengering. Setelah kering sampel direkatkan pada permukaan tembaga untuk di-coating emas menggunakan E IS-2 Ion Coater. Sampel diamati dengan Mikroskop Elektron Jeol JSM-5310LV Scanning Microscope di Laboratorium Zoologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Penelitian Indonesia, Cibinong.
BAB 4