DAFTAR LAMPIRAN
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Juni – Desember 2014. Penelitian bertempat di Pusat Penelitian Oseanografi LIPI Ancol Jakarta; Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Departemen Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB; Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB; Laboratorium Kimia Analitik, Kimia IPB; Pusat Studi Biofarmaka IPB; Laboratorium Pharmacy Sterile Technology dan Laboratorium Penelitian I, Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah keong matah merah yang diperoleh dari Pasar Muara Angke Jakarta. Berdasarkan informasi dari penjual, keong matah merah ini dipasok dari Desa Simpang Tiga Jaya, Kecamatan Tulung Selapan, Kabupaten Oki, Sumatra Selatan. Bahan yang digunakan untuk karakterisasi keong matah merah diantaranya alkohol 70%, selenium, H2SO4
pekat, NaOH 40%, H3BO3 2%, bromcresol green-methyl red, HCl 0,1 N dan benzena. Bahan yang digunakan pada ekstraksi dan karakterisasi ekstrak keong matah merah diantaranya daging keong matah merah, metanol, etil asetat, n-heksan, larva udang A. salina, H2SO4 pekat, NaOH, pereaksi Meyer, Wagner dan Dragendroff, pereaksi Liebermann-Burchard, kloroform dan HCl. Bahan yang digunakan pada pengujian aktivitas komponen bioaktif diantaranya Dimethyl Sufoxide (DMSO), Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH), etanol pro analis dan vitamin C, bufer fosfat, p-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside (p-NPG), enzim α -glukosidase, Na2CO3, akarbosa (Glucobay ® tablet), darah, dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4.2H2O), natrium dihidrogen fosfat (NaH2PO4.H2O), NaCl fisiologis, Na diklofenak, Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Muller Hinton Agar (MHA), biakan E. coli, biakan S. aureus dan kloramfenikol.
Alat yang digunakan pada karakterisasi keong matah merah diantaranya
cool box, timbangan, jangka sorong, oven, desikator, destilator, seperangkat alat soklet. Alat yang digunakan pada ekstraksi dan karakterisasi ekstrak keong matah merah diantaranya Erlenmeyer, shaker, rotary evaporator (EYELA N1001T),
komponen bioaktif keong matah merah diantaranya spektrofotometer UV-Vis (Hitachi U-2910), elisa reader (Epoch), sentrifuge (Hettich EBA20), autoclave
(ALP KT40) dan pHmeter (Horiba F-52).
Prosedur Kerja
Identifikasi sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi LIPI, Ancol, Jakarta. Sampel dibawa menuju laboratorium dalam keadaan hidup, dengan menggunakan cool box, kemudian dilakukan pengawetan dengan merendam sampel pada alkohol 70% pada wadah yang sudah diberi label. Identifikasi dilakukan dengan menggunakan kunci identifikasi Siput dan Kerang Indonesia (Dharma 1992) dan The Encyclopedia of Shells (Dance 1974).
Pengamatan morfometrik (Mujiono 2011)
Morfometrik merupakan peneraan pengukuran morfologi yang meliputi ukuran panjang dan berat, serta skala kondisi fisik berdasarkan standar morfologi tubuh. Pengamatan morfometrik cangkang keong matah merah dilakukan meliputi pengukuran panjang cangkang, lebar cangkang, lebar kolumela dan berat cangkang.
Perhitungan proporsi (Firdaus et al. 2013)
Proporsi merupakan perbandingan dari bagian-bagian terhadap keseluruhan. Perhitungan proporsi keong matah merah meliputi bagian cangkang, daging dan jeroan. Bagian daging selanjutnya digunakan untuk analisis proksimat.
Perhitungan proporsi:
Proporsi (%) = x 100%
Analisis proksimat
a. Kadar air (AOAC 2005)
Cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 105ºC selama 1 jam. Cawan tersebut kemudian diletakkan ke dalam desikator selama 15 menit, dibiarkan sampai dingin dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105ºC selama 5 jam atau hingga beratnya konstan. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali.
Perhitungan kadar air :
Kadar air (%) = x 100% Keterangan :
A = Berat cawan kosong (g)
B = Berat cawan yang diisi dengan sampel (g)
C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (g)
b. Kadar abu (AOAC 2005)
Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105ºC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Cawan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600ºC selama 6 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan.
Perhitungan kadar abu:
Kadar abu (%) = x 100% Keterangan :
A = Berat cawan porselen kosong (g) B = Berat cawan dengan sampel (g)
C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (g) c. Kadar protein (AOAC 2005)
Sampel sebanyak 0,25 g dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, kemudian ditambahkan 0,25 g selenium dan 3 ml H2SO4 pekat. Sampel didestruksi pada suhu 410oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Aquadest sebanyak 50 ml dan 20 ml NaOH 40% ditambahkan ke dalam labu Kjeldahl, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100ºC. Destilat ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2% dan 2 tetes indikator bromcresol green-methyl red
yang berwarna merah muda. Proses destilasi dihentikan setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan. Destilat kemudian dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh.
Perhitungan kadar protein:
N (%) = x 100%
Keterangan :
Faktor koreksi alat = 2,5 % Faktor konversi = 6,25
d. Kadar lemak (AOAC 2005)
Sampel sebanyak 5 g (A) dimasukkan ke dalam kertas saring dengan kedua ujungnya ditutup kapas bebas lemak. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam selongsong lemak dan disambungkan dengan kondensor dan labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (B). Sampel kemudian disiram dengan pelarut lemak (benzena). Refluks dilakukan selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor dan dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105ºC. Labu lemak kemudian didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (C).
Perhitungan kadar lemak:
Kadar lemak (%) = x 100% Keterangan :
A= Berat sampel (g)
B= Berat labu lemak kosong (g) C= Berat labu lemak dengan lemak (g) e. Kadar karbohidrat (AOAC 2005)
Analisis karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar lemak.
Perhitungan kadar karbohidrat:
Karbohidrat (%) = 100 % - ( kadar air + kadar abu + kadar protein + kadar lemak) Ekstraksi (Purwaningsih et al. 2008)
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut tunggal yaitu metanol (polar), etil asetat (semi polar) dan n-heksan (non polar). Sampel daging keong matah merah dimaserasi dengan pelarut dengan perbandingan 1:3 (b/v) dan diaduk menggunakan shaker selama 24 jam. Larutan ekstrak yang diperoleh disaring dengan kertas saring untuk memisahkan filtrat dan residunya. Proses tersebut diulang 3 kali. Filtrat yang dihasilkan kemudian dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 40ºC.
Perhitungan rendemen (Kridati et al. 2012)
Ekstrak keong matah merah yang diperoleh kemudian dihitung rendemennya. Rendemen merupakan perbandingan antara berat ekstrak yang dihasilkan dengan berat awal bahan yang dinyatakan dalam persen (%).
Perhitungan rendemen:
Uji deskripsi ekstrak (BPOM 2000)
Uji deskripsi ekstrak dilakukan dengan menggunakan panca indera langsung untuk mendeskripsikan bentuk, warna dan bau ekstrak. Uji deskripsi ekstrak keong matah merah bertujuan untuk mendapatkan karakteristik fisik ekstrak keong matah merah.
Uji toksisitas dengan metode BSLT (Juniarti et al. 2009)
Telur udang sebanyak 10 mg ditetaskan dalam 250 ml air laut di bawah lampu dan diaerasi dengan aerator selama 48 jam. Larutan induk sampel (2000 µg/ml) dibuat dengan cara melarutkan 20 mg sampel dalam 10 ml air laut dengan bantuan DMSO dan diencerkan pada konsentrasi 50, 100, 500, 1000 µg/ml. Sebanyak 100 µl air laut yang mengandung 10 ekor larva udang yang berumur 48 jam dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah uji dan ditambahkan larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 100 µl. Larutan diaduk sampai homogen dan dibiarkan selama 24 jam. Jumlah larva yang mati dan masih hidup dihitung dari tiap lubang.
Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi mati untuk konsentrasi 50 µg/ml = angka mati pada konsentrasi tersebut, akumulasi mati untuk konsentrasi 100 µg/ml = angka mati pada konsentrasi 50 µg/ml + angka mati pada konsentrasi 100 µg/ml, akumulasi mati untuk konsentrasi 500 µg/ml = angka mati pada konsentrasi 50 µg/ml + angka mati pada konsentrasi 100 µg/ml + angka mati pada konsentrasi 500 µg/ml, akumulasi mati untuk konsentrasi 1000 µg/ml = angka mati pada konsentrasi 50 µg/ml + angka mati pada konsentrasi 100 µg/ml + angka mati pada konsentrasi 500 µg/ml + angka mati pada konsentrasi 1000 µg/ml.
Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi hidup untuk konsentrasi 1000 µg/ml = angka hidup pada konsentrasi 1000 µg/ml, akumulasi hidup untuk konsentrasi 500 µg/ml = angka hidup pada konsentrasi 1000 µg/ml + angka hidup pada konsentrasi 500 µg/ml, akumulasi hidup untuk konsentrasi 100 µg/ml = angka hidup pada konsentrasi 1000 µg/ml + angka hidup pada konsentrasi 500 µg/ml + angka hidup pada konsentrasi 100 µg/ml, akumulasi hidup untuk konsentrasi 50 µg/ml = angka hidup pada konsentrasi 1000 µg/ml + angka hidup pada konsentrasi 500 µg/ml + angka hidup pada konsentrasi 100 µg/ml + angka hidup pada konsentrasi 50 µg/ml. Mortalitas dihitung dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = b(x) + a digunakan untuk mencari nilai LC50. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian larva A. salina
sebesar 50%.
Uji komponen aktif (Harbone 1987)
Uji Alkaloid : Sebanyak 0,1 g sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga peraksi alkaloid yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan perekasi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif
jika adanya endapan putih kekuningan untuk pereaksi Meyer, endapan coklat untuk Wagner dan endapan merah jingga untuk pereaksi Dragendorff.
Uji Flavonoid : Sebanyak 0,1 g sampel diekstrak dengan 2 ml metanol panas. Filtrat yang dihasilkan diteteskan pada plat tetes dan ditambahkan H2SO4
pekat. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya senyawa flavonoid dalam bahan.
Uji Fenol Hidrokuinon : Sebanyak 0,1 g sampel diekstrak dengan 2 ml metanol panas. Filtrat yang dihasilkan diteteskan pada plat tetes dan ditambahkan NaOH 10%. Terbentuknya warna kuning-merah menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.
Uji Steroid dan Triterpenoid : Sebanyak 0,1 g sampel ditambah dengan 2 ml kloroform dalam tabung reaksi, kemudian diteteskan ke dalam plat tetes dan dibiarkan sampai kering. Pereaksi Liebermann-Burchard ditambahkan sebanyak 1 tetes. Terbentuknya warna merah menandakan adanya senyawa triterpenoid dan terbentuknya warna biru atau ungu menandakan adanya senyawa steroid.
Uji Saponin : Sebanyak 0,1 g sampel ditambah dengan 20 ml aquades, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Larutan dituang ke dalam tabung reaksi dalam keadaan panas. Larutan diambil sebanyak 10 ml, kemudian dikocok kuat secara vertikal selama 10 detik. Adanya saponin ditandai dengan terbentuknya busa yang stabil setinggi 1-10 cm selama 10 menit dan tidak hilang pada saat ditambahkan dengan satu tetes HCl 2 N.
Uji aktivitas antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2009) a. Pembuatan larutan
Larutan induk sampel (10 mg/ml) dibuat dengan cara melarutkan sampel sebanyak 10 mg dalam 1 ml DMSO. Larutan induk sampel kemudian diencerkan dalam beberapa seri konsentrasi. Larutan DPPH 125 µM dibuat dengan cara melarutkan DPPH sebanyak 4,93 mg dengan etanol pro analis hingga 100 ml. b. Pengujian
Larutan induk sampel (metanol, etil asetat, n-heksan) keong matah merah diencerkan pada konsentrasi 50 µg/ml. Sampel sebanyak 100 µl kemudian dipindahkan ke dalam microplate menggunakan pipet mikro dan ditambahkan 100 µl DPPH. Blanko berisi 100 µl etanol pro analis dan 100 µl DPPH. Campuran tersebut diinkubasi pada ruang gelap suhu ruang selama 30 menit, kemudian absorbansinya diukur menggunakan Elisa Reader pada panjang gelombang 517 nm. Uji aktivitas antioksidan kembali dari ekstrak terbaik pada konsentrasi 200, 400, 600, 800 dan 1000 µg/ml dan kontrol positif vitamin C pada konsentrasi 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 dan 12,5 µg/ml. Persentase aktivitas inhibisi radikal bebas DPPH dihitung dengan persamaan: [(B – S)/B x 100], dimana B adalah absorbansi blanko dan S adalah absorbansi sampel, kemudian nilai konsentrasi dan inhibisi sampel diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linier. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = b(x) + a digunakan untuk mencari nilai IC50. Nilai IC50 menunjukkan konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menghambat radikal bebas sebesar 50%.
a. Pembuatan larutan
Larutan bufer fosfat pH 7 (100 mM) dibuat dengan cara melarutkan 1,3609 g KH2PO4 dan 1,4150 g K2HPO4 dengan akuabides hingga 100 ml. Larutan
enzim α-glukosidase dibuat dengan cara melarutkan 1 mg enzim α-glukosidase
dengan bufer fosfat pH 7 yang mengandung 200 mg BSA hingga 100 ml dan diencerkan sebanyak 25 kali sebelum digunakan. Larutan p-NPG 10 mM dibuat dengan cara melarutkan 0,1507 g p-NPG dengan bufer fosfat pH 7 hingga 50 ml. Larutan Na2CO3 200 mM dibuat dengan cara melarutkan 1,0599 g Na2CO3 dengan bufer fosfat pH 7 hingga 50 ml. Larutan induk sampel (100 mg/ml) dibuat dengan cara melarutkan 100 mg sampel dalam 1 ml DMSO. Larutan induk Glucobay (10 mg/ml) dibuat dengan cara melarutkan 1 g tablet Glucobay dengan 100 ml larutan HCl 2N : akuades (1:1), kemudian disentrifus. Supernatan yang dihasilkan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditepatkan dengan akuabides.
b. Pengujian
Larutan induk ekstrak (metanol, etil asetat, n-heksan) keong matah merah diencerkan pada konsentrasi 25 mg/ml. Larutan ekstrak sebanyak 10 µl ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 25 µl p-NPG (10 mM) dan 50 µl bufer fosfat pH 7. Reaksi dimulai dengan penambahan 25 µl larutan enzim dan 25 µl bufer fosfat dilanjutkan dengan inkubasi selama 30 menit pada 37ºC. Reaksi dihentikan dengan penambahan 100 µl Na2CO3 (200 mM). Serapan larutan diukur menggunakan elisa reader pada panjang gelombang 410 nm. Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase tersaji pada Tabel 1.
Tabel 1 Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase
Larutan B1 (µl) B0 (µl) S1(µl) S0 (µl) DMSO 10 10 - - Sampel - - 10 10 Bufer fosfat 50 50 50 50 Substrat (p-NPG) 25 25 25 25 Enzim 0,04 unit/ml 25 - 25 - Bufer fosfat - 25 - 25
Inkubasi pada suhu 370C selama 30 menit
Na2CO3 100 100 100 100
Keterangan :
B1 = Absorbansi blanko B0 = Absorbansi kontrol blanko S1 = Absorbansi sampel S0 = Absorbansi kontrol sampel
Uji aktivitas antidiabetes dilakukan kembali dari ekstrak terbaik pada konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 mg/ml dan kontrol positif Glucobay pada konsentrasi 0,1; 0,5; 1; 5 dan 10 mg/ml. Persentase inhibisi α-glukosidase
ditentukan menggunakan persamaan: [(B1-B0)/(S1-S0)]x100%, dimana B1 adalah absorbansi blanko, B0 adalah absorbansi kontrol blanko, S1 adalah
absorbansi sampel dan S0 adalah absorbansi kontrol sampel. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = b(x) + a digunakan untuk mencari nilai IC50. Nilai IC50 menunjukkan konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menghambat aktivitas α-glukosidase sebesar 50%.
Uji Aktivitas Antiinflamasi (Ravi et al. 2012) a. Pembuatan larutan
Larutan Na2HPO4.2H2O (0,15 M) dibuat dengan cara melarutkan 2,671 g Na2HPO4.2H2O dengan akuades hingga 100 ml. Larutan NaH2PO4.H2O (0,15 M) dibuat dengan cara melarutkan 2,070 g NaH2PO4.H2O dengan akuades hingga 100 ml. Larutan dapaf fosfat pH 7,4 (0,15 M) dibuat dengan cara mencampurkan 81 ml larutan Na2HPO4.2H2O (0,15 M) dengan 19 ml larutan NaH2PO4.H2O (0,15 M), kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 115οC selama 30 menit. Larutan isosalin dibuat dengan cara melarutkan 0,85 g NaCl dengan dapar fosfat pH 7,4 (0,15 M) hingga 100 ml, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 115οC selama 30 menit. Larutan hiposalin dibuat dengan cara melarutkan 0,25 g NaCl dengan dapar fosfat pH 7,4 (0,15 M) hingga 100 ml, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 115οC selama 30 menit. Larutan induk sampel (10 mg/ml) dibuat dengan cara melarutkan 100 mg sampel dalam 10 ml larutan isosalin dengan bantuan DMSO.
b. Pembuatan suspensi sel darah merah
Darah dari Palang Merah Indonesia (PMI) sebanyak 10 ml disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan menggunakan pipet steril. Endapan sel-sel darah yang tersisa kemudian dicuci dengan larutan isosalin (0,85%, pH 7,2) dan disentrifugasi kembali. Proses tersebut diulang 4 kali sampai isosalin jernih. Volume sel darah merah diukur dan diresuspensi dengan isosalin sehingga didapatkan suspensi sel darah merah dengan konsentrasi 10% v/v.
c. Pengujian
Larutan sampel terdiri dari 1 ml dapar fosfat pH 7,4; 2 ml hiposalin; 0,5 ml suspensi sel darah merah dan 1 ml sampel. Larutan kontrol sampel terdiri dari 1 ml dapar fosfat pH 7,4; 2 ml hiposalin; 0,5 ml isosalin dan 1 ml sampel. Larutan kontrol negatif terdiri dari 1 ml dapar fosfat pH 7,4; 2 ml hiposalin; 0,5 ml suspensi sel darah merah dan 1 ml isosalin. Semua larutan uji diinkubasi pada suhu 56°C selama 20 menit dan disentrifugasi. Cairan supernatan selanjutnya diambil dan kandungan hemoglobinnya diperhitungkan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 560 nm. Uji aktivitas antiinflamasi dilakukan kembali pada konsentrasi 500, 1000, 2000, 4000 dan 6000 µg/ml dan kontrol positif Na diklofenak pada konsentrasi 200, 400, 600, 800 dan 1000 µg/ml. Persentase stabilitas membran sel darah merah dapat dihitung dengan persamaan : 100-[(S-KS/K)x100%], dimana S adalah absorbansi sampel, KS adalah absorbansi kontrol sampel dan K adalah absorbansi kontrol negatif, kemudian nilai konsentrasi dan stabilitas diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linier. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = b(x) + a digunakan untuk mencari nilai IC50. Nilai
IC50 menunjukkan konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menstabilkan membran sel darah merah sebesar 50%.
Uji aktivitas antibakteri (Rasyid 2012) a. Pembuatan media
Media NA dibuat dengan cara melarutkan 1,4 g nutrient agar dalam 50 ml akuades dan dihomogenkan dengan memanaskan di atas hotplate. Masing-masing sebanyak 5 ml NA dimasukkan dalam tabung reaksi, ditutup dengan kapas dan disterilkan dengan autoklaf 121οC selama 15 menit. Tabung reaksi berisi NA kemudian dimiringkan sampai NA membeku.
Media NB dibuat dengan cara melarutkan 1,3 g nutrient broth dalam 100 ml akuades dan dihomogenkan dengan memanaskan di atas hotplate. Masing-masing sebanyak 9 ml NB dimasukkan dalam tabung reaksi ditutup dengan kapas dan disterilkan dengan autoklaf 121οC selama 15 menit.
Media MHA dibuat dengan cara melarutkan 7,6 g muller hinton agar dalam 200 ml akuades dan dihomogenkan dengan memanaskan di atas hotplate. Masing-masing sebanyak 20 ml MHA dimasukkan dalam tabung reaksi ditutup dengan kapas dan disterilkan dengan autoklaf 121οC selama 15 menit.
b. Penyegaran dan pembuatan suspensi bakteri
Penyegaran bakteri dilakukan dengan memindahkan 1 ose bakteri dari stok ke tabung reaksi berisi media NA. Inkubasi dilakukan pada suhu 37οC selama 24 jam. Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan memindahkan 1 ose bakteri dari media NA ke dalam media NB yang telah dingin secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37οC selama 24 jam. Biakan bakteri yang telah diinkubasi kemudian diukur optical density (OD) pada panjang gelombang 600 nm dengan nilai antara 0,5 – 0,8.
c. Pembuatan larutan
Larutan induk ekstrak (100 mg/ml) dibuat dengan cara melarutkan 100 mg sampel dalam 1 ml DMSO, kemudian diencerkan pada beberapa seri konsentrasi. Larutan induk kloramfenikol (10 mg/ml) dibuat dengan cara melarutkan 10 mg kloramfenikol dalam 1 ml DMSO, kemudian diencerkan pada konsentrasi 1 mg/ml.
d. Pengujian
Media MHA yang dibuat sebelumnya dipanaskan kemudian ditambahkan 20 µl bakteri dan di vortek kemudian dituang dalam cawan petri steril, goyangkan membentuk angka 8 dan diamkan selama 15 menit sampai membeku. Masing-masing paper disk yang telah ditetesi ekstrak sebanyak 20 µl diletakkan dalam cawan petri menggunakan pinset steril. Bakteri kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur dengan jangka sorong. MIC (Minimum Inhibitory Concentration) menunjukkan konsentrasi sampel minimum yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji.
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh dari hasil penelitian dilakukan uji normalitas dan homogenitas, kemudian dilakukan analisis sidik ragam dan jika berpengaruh nyata maka diuji lanjut menggunakan uji Duncan (Steel dan Torrie 1993).
Hipotesis
H0 : Perbedaan konsentrasi ekstrak tidak berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan, antidiabetes, antiinflamasi dan antibakteri keong matah merah. H1 : Perbedaan konsentrasi ekstrak berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan,
antidiabetes, antiinflamasi dan antibakteri keong matah merah.
Model observasi Rancangan Acak Lengkap (RAL) adalah sebagai berikut :
Yij = μ + αi + ɛ ij Keterangan :
Yij : Respon pengaruh perlakuan pada taraf i ulangan ke-j
μ : Pengaruh rata-rata umum
αi : Pengaruh perlakuan pada taraf ke-i
ɛ ij : Pengaruh acak (galat percobaan) pada konsentrasi taraf i ulangan ke-j j : 1,2, dan 3
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Keong Matah Merah
Identitas keong matah merah
Hasil identifikasi keong matah merah menunjukkan bahwa sampel yang digunakan pada penelitian ini merupakan spesies Cerithidea obtusa. Sertifikat identifikasi sampel tersaji pada Lampiran 1. Adapun klasifikasi Cerithidea obtusa
adalah Filum Moluska, Kelas Gastropoda, Ordo Mesogastropoda, Famili Potamididae, Genus Cerithidea dan Spesies Obtusa. Menurut Houbrick (1984), mesogastropoda dari keluarga Potamididae merupakan siput intertidal yang umum dan banyak dijumpai di habitat berlumpur dan muara. Sebagian besar terbatas pada daerah tropis dan subtropis, mereka merupakan fauna yang mencolok pada hutan bakau dan rawa-rawa payau dimana makanannya berupa detritus dan mikroalga. Famili Potamididae terdiri dari berbagai genus dengan bentuk cangkang yang beragam. Famili Potamididae dibagi menjadi dua sub famili yaitu Potamidinae dan Batillariinae yang secara sederhana dibedakan oleh struktur radularnya. Genus Cerithidea adalah kelompok terbesar pada sub famili Potamidinae.
Keong matah merah merupakan salah satu spesies dari genus Cerithidea
yang memiliki bentuk yang khas dengan panjang antara 3-5 cm, memiliki cangkang berpola ulir berwarna merah kecoklatan dengan ujung cangkang tumpul, serta warna kemerahan pada mata dan bagian kaki. Menurut Karyanto et al. (2004), beberapa karakteristik penting yang digunakan untuk identifikasi secara morfologi cangkang diantaranya bentuk umum, ukuran cangkang, warna
cangkang, spire, whorl dan aperture. Keong matah merah memiliki cangkang berbentuk piramidial memanjang dengan warna coklat kemerahan dan putih dengan pola berulir, body whorl tidak tampak jelas sedangkan unit whorl dan
spire yang jelas, aperture berbentuk bulat tanpa saluran siphon yang membentuk celah pada sudut aperture, apex yang tererosi sehingga membentuk ujung cangkang yang tumpul. Struktur apex inilah yang menjadi ciri khas spesies
cerithidea obtusa untuk dibedakan dengan jenis cerithidea yang lain, sehingga penamaan obtusa digunakan (obtusus = tumpul). Keong matah merah yang digunakan pada penelitian ini tersaji pada Gambar 2.
Gambar 2 Keong matah merah (Karyanto et al., 2004)
Keong matah merah adalah spesies umum pada ekosistem mangrove di kawasan Asia-Pasifik. Ekosistem mangrove merupakan lingkungan yang
ekstrim karena dipengaruhi oleh pasang surut air laut, suhu dan salinitas yang berubah-ubah. Kondisi tersebut menyebabkan keong matah merah memiliki kemampuan beradaptasi untuk tetap dapat bertahan hidup. Menurut Ernanto et al.
(2010), adaptasi gastropoda mencakup daya tahan terhadap kehilangan air dan pemeliharaan keseimbangan panas tubuh. Gastropoda masuk ke dalam cangkang ketika pasang turun, kemudian menutup celah menggunakan operkulum sehingga kehilangan air dapat dikurangi. Gastropoda juga memiliki toleransi terhadap suhu