INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
DAFTAR PUSTAKA
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap yaitu karaterisasi isolat NS(9), penapisan senyawa antibakteri dari isolat NS(9), dan penentuan waktu optimum produksi antibakteri dari isolat NS(9).
3.3.1 Karakterisasi isolat NS(9)
Tahap karakterisasi isolat NS(9) bertujuan untuk mengetahui karakter isolat NS(9) sebagai dugaan awal bakteri asam laktat. Tahap ini dilakukan dengan menguji isolat NS(9) dengan beberapa uji seperti uji motilitas, uji fermentasi glukosa, uji katalase, pewarnaan Gram, dan pewarnaan spora. Pengamatan
morfologi dan produksi asam laktat dilakukan terhadap koloni NS(9) yang terbentuk pada permukaan agar MRS + CaCO3 sebanyak 0,5%.
1) Uji motilitas (Tiwari et al. 2009).
Uji motilitas dilakukan dengan menusuk isolat NS(9) yang telah disegarkan melalui metode refresh isolat selama dua hari ke dalam agar Sulfate Indole Motility (SIM) pada tabung reaksi. Isolat NS(9) yang diawetkan dalam gliserol disegarkan kembali dengan agar MRS miring selama dua hari dalam inkubator bersuhu 37oC. Isolat NS(9) yang telah disegarkan diambil dengan kawat penusuk yang sudah disteril, kemudian ditusukkan ke dalam media agar SIM steril. Hasil uji isolat yang motil ditunjukkan dengan penyebaran isolat ke seluruh media yang menyebabkan media tersebut keruh (Tiwari et al. 2009).
2) Uji fermentasi glukosa (Hayward 1957).
Pendeteksian produksi gas dari isolat NS(9) dilakukan dengan metode fermentasi glukosa dalam tabung Durham. Uji fermentasi glukosa dilakukan dengan menginokulasikan isolat NS(9) pada media MRS Broth steril yang sudah dicampur glukosa 10% hingga larut. Isolat NS(9) diinokulasikan secara aseptik ke dalam media MRS Broth + glukosa 10% dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Hasil uji heterofermentatif ditunjukkan dengan adanya gas yang terbentuk dalam tabung Durham.
3) Uji katalase (Cappucino dan Sherman 1983).
Uji katalase dilakukan pada biakan isolat NS(9). Satu ose koloni bakteri dioleskan pada kaca objek kering dan diteteskan 2-3 tetes 3% H2O2. Bila
terbentuk gelembung udara, maka bakteri dinyatakan katalase positif. Bakteri aerob memberikan reaksi positif, sebaliknya pada bakteri anaerob.
4) Uji perwarnaan Gram (Tiwari et al. 2009).
Uji pewarnaan Gram dilakukan dengan mewarnai biakan isolat NS(9) dengan pewarna kristal ungu dan safranin. Isolat digores diatas kaca preparat untuk difiksasi. Isolat yang telah difiksasi diteteskan kristal ungu dan ditunggu selama satu menit. Setelah itu isolat disiram dengan air dan diteteskan iodium. Isolat disiram kembali dengan air dan dilakukan pemucatan dengan alkohol 95%. Setelah disiram kembali dengan air, isolat diberi pewarna tandingan safranin selama 30 detik. Isolat dibilas kembali dengan air dan diamati dibawah mikroskop
dengan perbesaran 10x100. Gram positif berwarna biru gelap sedangkan Gram negatif berwarna merah (Tiwari et al. 2009).
5) Uji pewarnaan spora (Tiwari et al. 2009).
Uji pewarnaan spora dilakukan dengan mewarnai spora yang terbentuk pada isolat NS(9) dengan malasit hijau. Isolat difiksasi diatas kaca preparat, kemudian ditetesi pewarna malasit hijau. Preparat dipanaskan diatas api yang berjarak kurang lebih 10 cm selama 10 menit. Preparat dicuci dengan air dan ditetesi safranin. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x100. Endospora yang terbentuk ditandai dengan adanya warna hijau, sedangkan sel vegetatif berwarna merah (Tiwari et al. 2009).
6) Pengamatan morfologi koloni (Tiwari et al. 2009).
Pengamatan morfologi koloni isolat NS(9) dilakukan dengan mengamati morfologi koloni isolat NS(9)yang terbentuk pada agar MRS. Pengamatan yang dilakukan meliputi warna koloni, bentuk permukaan, bentuk tepian, bentuk koloni.
7) Pendeteksian asam laktat (Kopermsub dan Yunchalard 2010).
Pendeteksian adanya senyawa asam laktat yang terbentuk dilakukan dengan pengujian isolat NS(9) diatas media agar MRS yang dicampur dengan CaCO3 dengan perbandingan 0,5 gram CaCO3 dalam 100 mL MRS agar. Isolat
digores keatas cawan yang berisi agar MRS + CaCO3. Selanjutnya cawan
diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37 oC selama 2 hari. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna media dari keruh menjadi lebih bening.
3.3.2 Penapisan senyawa antibakteri dari isolat NS(9)
Tahap selanjutnya adalah penapisan senyawa antibakteri dari isolat NS(9) yang bertujuan untuk mengetahui potensi dan jenis zat antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9). Isolat yang disimpan pada gliserol disegarkan pada agar MRS miring dan selanjutnya diinkubasi dalam kaleng yang disimpan dalam inkubator pada suhu 37oC selama 48 jam. Isolat yang telah disegarkan pada media MRSA kemudian diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam media MRS broth sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi pada suhu 37oC pada shaker shaker water bath
selama 18 jam hingga OD660 inokulum mencapai 0,6 hingga 0,8 untuk selanjutnya
Sebanyak 10% inokulum dimasukkan ke dalam media produksi dengan volume kerja 100 mL, kemudian diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan yang dilakukan adalah pengukuran OD awal dan OD akhir inkubasi (24 jam). Setelah 24 jam kemudian, dilakukan pemanenan.
Pemanenan dilakukan dengan cara sentrifugasi media kultivasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisah dari biomassa, setelah itu supernatan diberi tiga perlakuan, yaitu: (1) supernatan yang tidak diberi perlakuan apa-apa sehingga kondisi asam pada supernatan tetap terjaga (diberi label A); (2) supernatan yang diberikan perlakuan penambahan NaOH 1 N atau penetralan untuk menghilangkan zat asam yang ada pada supernatan (diberi label N); (3) supernatan yang telah dinetralkan pH-nya dan dilakukan pengendapan protein (diberi label E). pengendapan dilakukan dengan amonium sulfat sebanyak 50%, kemudian didiamkan selama 24 jam pada suhu
chilling (4oC). Selanjutnya cairan tersebut dipanen dengan menggunakan kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC. Endapan hasil sentrifuse dilarutkan dengan 0,1 M buffer fosfat pH 7.
Ketiga supernatan atau substansi tersebut (A, N, dan E) diuji aktivitas antibakterinya terhadap lima bakteri uji, yaitu Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus
dengan metode difusi sumur agar (agar well difusion). Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari isolat NS(9) dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir penapisan zat antibakteri. Tanpa penetralan Substansi A Penetralan dengan NaOH Substansi N Sentifugasi 10000 rpm 15 menit Penyaringan steril dengan milipore Penyaringan steril dengan milipore Biomassa Penyegaran isolat selama 48 jam
pada MRSA di suhu 37oC Isolat NS(9)
Produksi selama 24 jam pada MRSB di suhu 37oC
Sentifugasi 10000 rpm 15 menit
Supernatan
Pembuatan inokulasi 15 mL MRSB selama 24 jam di suhu
37oC Supernatan Endapan Pelarutan dengan 0,1 M buffer fosfat pH 7 Substansi E Uji aktivitas antibakteri Zona bening Penetralan dengan NaOH + diendapkan dengan amonium sulfat 50% Penyimpanan suhu 4oC selama 24 jam
3.3.3 Penentuan waktu optimum produksi zat antibakteri (modifikasi Sarika et al. 2010)
Tahap ini dimulai dengan penyegaran isolat NS(9) yang diisolasi dari bekasam ikan nila (Oreochromis niloticus). Penyegaran dilakukan dengan penggoresan isolat yang disimpan pada gliserol pada agar MRS miring dan selanjutnya diinkubasi dalam kaleng pada suhu 37oC di dalam inkubator selama 48 jam. Isolat yang telah disegarkan pada media MRSA kemudian diambil dengan menggunakan ose untuk membuat inokulum pada media MRS broth. Inokulum diinkubasi pada suhu 37oC selama 18 jam hingga OD inokulum mencapai 0,8 hingga 1.
Selanjutnya 10% inokulum tersebut ditumbuhkan ke media produksi dengan volume kerja 10 mL, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC. Pengamatan dilakukan setiap tiga jam selama 24 jam. Parameter yang diamati antara lain OD660 dan pH untuk tiap label tabung. Tahap selanjutnya adalah pemanenan untuk
mendapatkan supernatan. Parameter yang diukur dari supernatan yaitu aktivitas antibakteri, kadar asam laktat, dan kadar protein yang diukur dengan metode Bradford (Nielsen 2010).
a) Tahap analisis uji aktivitas antibakteri
Tahap uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode sumur agar (agar well difusion). Pengujian diawali dengan persiapan media MHA yang sudah terisi dengan bakteri uji Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, dan
Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus. Tahap persiapan media MHA dilakukan dengan mencampur media MHA steril pada suhu 50oC dan NB berisi bakteri uji dengan perbandingan antara 10 µl NB bakteri uji untuk 10 mL MHA steril. Media MHA yang sudah berisi bakteri uji tersebut disiapkan dalam cawan steril dan kemudian dilubangi sebesar ujung pipet Pasteur sehingga terbentuk sumur kecil yang mampu terisi oleh supernatan isolat NS(9) yang diperoleh dari proses pemanenan. Sumur-sumur tersebut kemudian diisi dengan supernatan isolat bakteri NS(9), kemudian diinkubasi selama 21 jam untuk melihat zona bening yang terbentuk pada tiap bakteri uji dan masing-masing supernatan. Pengukuran diameter zona bening dilakukan untuk pembuatan kurva zona bening setiap bakteri uji per waktu panen.
b) Pengukuran kadar asam laktat
Pengukuran kadar asam laktat dilakukan dengan metode titrasi asam basa menggunakan larutan NaOH (N=0,1091) (Moore et al. 2011). Setiap supernatan dilarutkan dengan pewarna fenoftalein, kemudian dititrasi oleh NaOH hingga warna larutan supernatan berubah kemerahan. Volume NaOH yang terpakai digunakan untuk melakukan perhitungan % asam laktat yang dihitung menggunakan rumus:
% Asam Laktat = × × × × 100%
Keterangan:
V NaOH = Volume NaOH yang terpakai
N NaOH = Normalitas NaOH yang terukur (0,1091) FP = Faktor Pengencer (1)
Bobot sampel = 1000 mg 90 = BM Asam laktat
c) Analisis kadar protein dengan metode Bradford (Nielsen 2010)
Pengujian kandungan protein pada supernatan dilakukan dengan metode Bradford. Metode ini mengandalkan sifat amfoter dari protein. Ketika protein terasamkan hingga mencapai titik isoelektrik, zat warna akan terikat secara elektrostatik. Efisiensi pengikatan dipacu oleh interaksi hidrofobik oleh molekul pewarna dengan polypeptide backbone bermuatan positif yang berdekatan dalam protein. Pada uji Bradford, pewarna terikat pada protein mengubah absorbansi spektrum terhadap pewarna yang tidak terikat.
Ketika Coomasie Brillian Blue G-250 terikat pada protein, warna Reagen Coomassie Blue yang bebas berwarna merah kecokelatan (λ = 465 nm), akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membenuk warna biru (λ = 595 nm). Jumlah Coomassie Blue terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein dan dilakukan pengukuran optical densitydengan spektrofotometer pada λ = 660 nm.
Pembuatan reagen Coomassie Blue dilakukan dengan mencampurkan Coomassie Blue G-250 sebanyak 50 mg dengan 25 mL etanol 95% hingga larut. Larutan ini kemudian dicampur dengan 50 mL asam fosfat 85%, dan diencerkan
dengan akuades hingga 500 mL. larutan ini disaring dengan kertas saring. Larutan yang telah disaring inilah yang digunakan untuk pengukuran protein. Reagen Coomassie Blue yang sudah disaring dicampur pada kontrol yaitu akuades, dan dicampur ke dalam semua supernatan. Nilai absorbansi yang terukur dicatat untuk pengukuran kadar protein selanjutnya.
Proses penentuan kadar protein dilakukan dengan pembuatan kurva standar dari BSA (bovine serum albumin) pada konsentrasi 0,01 mg/mL hingga 0,14 mg/mL dengan menggunakan metode Bradford. Nilai absorbansi yang terukur dicatat dan digambar pada kurva standar untuk menentukan rumus penentuan kadar protein sampel. Rumus yang didapat dari kurva standar tersebut digunakan untuk mengukur kadar protein pada sampel uji, dalam hal ini adalah supernatan. Diagram alir penentuan waktu panen optimum zat antibakteri dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Diagram alir penentuan waktu optimum produksi. Penyegaran isolat selama 48 jam
pada MRSA di suhu 37oC Isolat NS(9)
Produksi selama 24 jam pada MRSB dengan suhu 37oC dalam inkubator
Pengamatan OD660 dan pH setiap 3 jam
Pembuatan inokulum 15 mL MRSB selama 24 jam di suhu
37oC
Biomassa
Sentifugasi 10.000 rpm selama 15 menit
Supernatan
- Pengukuran zona bening - Pengukuran kadar asam laktat - Pengukuran kadar protein
Analisis zat antibakteri isolat NS(9) dari bekasam ikan nila (Oreochromis niloticus) terdiri dari tiga tahap penelitian. Tahap pertama adalah karakterisasi isolat NS(9) yang bertujuan untuk mengetahui karakter awal dari isolat NS(9). Tahap kedua adalah penapisan zat antibakteri pada isolat NS(9) yang bertujuan untuk mengetahui potensi dan jenis antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9). Tahap ketiga adalah penentuan waktu optimum produksi senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9). Ketiga tahap tersebut menunjukkan potensi senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9) dan optimasi produksinya.
4.1 Karakterisasi Isolat NS(9)
Karakteriasi isolat NS(9) bertujuan untuk mengetahui karakter dari isolat NS(9). Uji karakterisasi yang dilakukan antara lain uji pewarnaan Gram, uji pewarnaan spora, uji fermentasi glukosa, uji katalase, uji motilitas, dan pengamatan morfologi koloni. Hasil uji karakterisasi tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil pengujian karakterisasi isolat NS(9)
Jenis Uji Hasil Gambar
Uji motilitas Negatif (-):
Isolat tidak menyebar
Uji pewarnaan Gram
Positif (+):
Preparat berwarna biru
Jenis Uji Hasil Gambar
Uji pewarnaan spora
Negatif (-): Preparat berwarna merah
Uji fermentasi glukosa
Negatif (tidak
terbentuk gelembung gas dalam tabung Durham): Homofermentatif Uji katalase Negatif (-): Tidak terbentuk gelembung pada H2O2 2% - Morfologi koloni
Bentuk tepian halus Bentuk koloni bulat Permukaan cembung Warna putih
Isolat NS(9) memiliki karakter antara lain sebagai berikut: tidak motil, Gram positif, spora negatif, homofermentatif, dan katalase negatif (Tabel 1). Hal ini sesuai dengan penyampaian Mozzi et al. (2010) dan Klaenhammer et al.
(2011) yang menyatakan bahwa bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif.
Mozzi et al. (2010) menyatakan bahwa bakteri asam laktat termasuk di dalamnya bakteri homofermentatif yang memproduksi sebagian besar utamanya adalah asam laktat, dan heterofermentatif yang selain memproduksi asam laktat juga memproduksi variasi yang luas dari produk fermentasi seperti asam asetat, etanol, gas karbon dioksida, dan asam format. Ketiadaan gelembung gas pada uji
fermentasi glukosa menunjukkan bahwa isolat NS(9) tidak menghasilkan gas karbon dioksida dalam jumlah yang besar. Menurut Hayward (1957), ketiadaan gas yang terbentuk pada isolat NS(9) menunjukkan bahwa isolat NS(9) diduga merupakan bakteri homofermentatif.
Pendeteksian bakteri asam laktat dengan metode lain adalah dengan penambahan kalsium karbonat (CaCO3) pada media agar MRS steril yang
ditumbuhkan isolat NS(9) diatasnya. Hasil pendeteksian asam laktat pada media agar MRS yang telah ditambahkan CaCO3 dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Perbandingan antara MRSA + CaCO3 yang steril (kiri) dan yang sudah
ditumbuhi isolat NS(9) (kanan).
Media agar MRS + CaCO3 yang steril terlihat keruh dan tidak terlalu
transparan karena ada kandungan CaCO3 yang ada di dalam media agar MRS
tersebut, sedangkan media agar MRS + CaCO3 yang sudah ditumbuhi isolat NS(9)
terlihat lebih transparan (Gambar 6). Hal ini disebabkan karena CaCO3 yang
terkandung dalam media agar MRS tersebut bereaksi dengan asam laktat yang dihasilkan NS(9) menjadi kalsium laktat sehingga warna media yang terlihat menjadi lebih bening dibandingkan media agar MRS + CaCO3 yang tidak
ditumbuhi isolat NS(9). Hal ini sesuai dengan penelitian Kopermsub dan Yunchalard (2010) yang menyatakan bahwa asam laktat dapat bereaksi dengan kalsium membentuk kalsium laktat dan membuat warna media menjadi lebih jernih.
4.2 Penapisan Senyawa Antibakteri dari Isolat NS(9)
Penapisan senyawa antibakteri dari isolat NS(9) bertujuan untuk mengetahui potensi dan jenis antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9). Isolat NS(9) yang telah dikultivasi selama 24 jam diambil supernatannya yang telah diberi kode A, N, dan E. Ketiga substansi tersebut diuji aktivitas antibakteri pada lima bakteri
patogen pada makanan yang menjadi bakteri uji, yaitu Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Salmonella typhimurium. Hasil uji aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil uji aktivitas antibakteri
Keterangan:
A = supernatan kondisi asam (tidak dinetralkan) N = supernatan dinetralkan dengan NaOH
E = supernatan dinetralkan dan diendapkan dengan amonium sulfat 50% - = tidak terdeteksi
Aktivitas antibakteri positif ditunjukkan pada substansi yang tidak diberi perlakuan, atau dengan kondisi asam yang dipertahankan. Substansi yang dinetralkan dan diendapkan proteinnya tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri (Tabel 2). Zona bening yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7 Aktivitas antibakteri substansi A, N dan E pada ketiga jenis bakteri: A) Bacillus cereus, B) Escherichia coli, C) Listeria monocytogenes
D) Staphylococcus aureus, E) Salmonella typhimurium. Bakteri
Rataan diameter zona bening (mm)
A N E S. aureus 2,5 - - B. cereus 6,5 - - E. coli 9,0 - - S. typhimurium 7,0 - - L. monocytogenes 8,5 - -
Zona bening tidak tampak sama sekali pada sumur yang diberikan substansi N dan E yang ditanam pada tiap bakteri uji (Gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri hanya terdeteksi pada substansi yang kondisi asamnya dipertahankan (A).
Theron dan Lues (2011) menyampaikan bahwa bakteri asam laktat menghasilkan senyawa sekunder yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain disekitarnya. Zat asam organik yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dapat menurunkan pH media dan menghambat pertumbuhan bakteri. Selain itu zat lain yang diproduksi oleh bakteri asam laktat seperti peroksida, diasetil, dan senyawa protein seperti bakteriosin diketahui dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain disekitarnya.
Perlakuan berbeda yang diaplikasikan pada ketiga supernatan isolat NS(9) bertujuan untuk mengidentifikasi jenis antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9). Supernatan yang tidak diberi perlakuan sama sekali (kode A) bertujuan untuk mempertahankan kondisi asam dan mengidentifikasi zat antibakteri yang bersifat asam. Perlakuan penetralan pada supernatan (kode N) bertujuan untuk menghilangkan efek antibakteri yang bersifat asam, sehingga hanya zat antibakteri yang bersifat non-asam saja yang bekerja menghambat pertumbuhan bakteri lain. Perlakuan pengendapan protein pada supernatan (kode E) bertujuan untuk mengendapkan protein dari supernatan dan mengetahui aktivitas antibakteri dari protein tersebut. Hasil dari percobaan ini menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri yang dihasilkan dari supernatan isolat NS(9) hanya terlihat pada supernatan yang diberi kode A. Berdasarkan hasil ini dapat disimpulkan bahwa isolat NS(9) tidak memproduksi antibakteri yang termasuk ke dalam jenis protein seperti bakteriosin pada pengendapan amonium sulfat 50%. Antibakteri yang dihasilkan oleh isolat NS(9) termasuk ke dalam jenis asam organik.
4.3 Penentuan Waktu Optimum Produksi Antibakteri
Pengukuran waktu optimum produksi antibakteri bertujuan untuk mengetahui waktu optimum produksi antibakteri yang dihasilkan dari isolat (NS9). Kultur isolat NS(9) yang ditumbuhkan dalam media produksi antibakteri
diamati setiap 3 jam selama 24 jam menunjukkan adanya pola perubahan pH, produksi protein dan asam laktat (Lampiran 1).
4.3.1 Pertumbuhan isolat dan perubahan pH
Pertumbuhan isolat bakteri NS(9) diukur dengan cara menginkubasikan bakteri isolat pada media MRSB selama 24 jam. Pengukuran dilakukan setiap tiga jam sekali. Pengukuran yang dilakukan meliputi pengukuran nilai absorbansi media pada panjang gelombang 660 nm serta pengukuran nilai pH. Hasil pengukuran nilai absorbansi untuk optical density (OD) dan nilai pH setiap tiga jam selama 24 jam dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Grafik nilai Optical Density (OD) ( ), dan pH ( ) bakteri isolat NS(9) selama fase produksi 24 jam.
Fase pertumbuhan yang berbeda-beda terlihat selama 24 jam inkubasi dari isolat NS(9) (Gambar 8). Pertumbuhan isolat mulai terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-15. Fase ini disebut dengan fase eksponensial (fase log). Cohen (2011) menyatakan bahwa fase eksponensial terjadi karena konsumsi nutrisi dalam media oleh kultur. Hal tersebut mengakibatkan kultur berkembang pada growth rate
yang konstan, dimana growth rate proporsional terhadap nilai OD. Pommerville (2011) menyatakan fase log terjadi ketika semua sel dalam kultur mengalami pembelahan biner. Setiap generasi yang dilalui, jumlah sel bertambah dua kali lipat dan grafik meningkat dalam bentuk garis lurus atau grafik logaritmik.
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 0 3 6 9 12 15 18 21 24 O D & p H
Pertumbuhan isolat melambat pada fase yang ditunjukkan pada jam ke-6 hingga jam ke-15. Pertumbuhan tersebut bertambah secara simultan, konstan, dengan growth rate yang hampir mendekati nol. Cohen (2011) menyatakan bahwa hal tersebut terjadi karena nutrien yang hilang akibat konsumsi, medium yang semakin asam, akumulasi toksik atau karena zat yang dapat menghambat pertumbuhan. Meskipun demikian, pertumbuhan masih tetap terjadi.
Kurva pertumbuhan mengalami kecenderungan stasioner pada jam ke-15 hingga jam ke-21. Cohen (2011) menyatakan bahwa kondisi nutrien yang hilang akibat konsumsi, medium yang semakin asam, akumulasi toksik atau karena zat yang dapat menghambat pertumbuhan menyebabkan pertumbuhan semakin menurun sehingga level pertumbuhan akan mendekati nol dan penambahan jumlah sel tidak ada.
Penurunan grafik OD pada jam ke-21 hingga jam ke-24 menunjukkan bahwa isolat NS(9) memasuki fase kematian (decline phase). Pommerville (2011) menyatakan bahwa hal ini terjadi karena nutrien dalam media yang tersisa terbatas atau jumlahnya menjadi jauh lebih rendah.
Kecenderungan penurunan nilai pH mulai dari waktu inkubasi awal pada jam ke-0 hingga jam ke-12 (Gambar 8). Nilai pH pada jam ke-12 hingga jam ke- 24 sudah menunjukkan kestabilan dimana nilai pH tetap tidak berubah hingga akhir masa inkubasi, yaitu 4.
Hubungan yang terlihat antara nilai absorbansi dan nilai pH pada tahap ini adalah perbandingan terbalik. Ketika isolat NS(9) pertama kali diinkubasi pada jam ke-0, pH yang terlihat menunjukkan nilai yang tertinggi yaitu 6, sedangkan nilai absorbansi pada waktu awal inkubasi memiliki nilai terendah, yaitu 0,19. Ketika kepadatan isolat bertambah ditandai dengan naiknya nilai OD hingga mencapai 6,48 pada jam ke-12, nilai pH yang ditunjukkan menurun dari 6 hingga 4. Nilai pH 4 ini merupakan nilai pH yang terendah dan tidak berubah hingga fase
death yang ditunjukkan pada menurunnya nilai OD dari jam ke-21 hingga jam ke-24.
Hwang et al. (2011) menyatakan bahwa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat seperti asam laktat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti komposisi media (sumber karbohidrat, konsentrasi gula, dan faktor
pertumbuhan), keberadaan oksigen, tingkat pH, dan konsentrasi metabolit sekunder dari produk. Fase eksponensial pada jam ke-0 hingga jam ke-15 menunjukkan peningkatan nilai OD, yang diakibatkan oleh kandungan media MRS broth yang kaya akan nutrisi pertumbuhan bakteri asam laktat seperti pepton dan glukosa. Adanya glukosa memacu terjadinya proses fermentasi yang menghasilkan senyawa metabolit sekunder seperti asam laktat. Zat ini terus diproduksi hingga konsentrasinya meninggi. Hwang et al. (2011) juga menyatakan bahwa konsentrasi asam laktat yang tinggi juga dapat memperlambat pertumbuhan sel selama masa fermentasi. Oleh karena itu, semakin banyak asam laktat yang diproduksi selama masa fermentasi (ditandai dengan penurunan nilai pH pada grafik), maka pertumbuhan sel yang terjadi semakin lambat. Kondisi media yang semakin minim nutrisi akibat proses fermentasi yang terus menerus