Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Balai Inseminasi Buatan Lembang dan di Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Bagian Reproduksi dan Kebidanan. Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Dilaksanakan pada bulan Juli 2013 sampai bulan Desember 2013.
Materi Penelitian
Sampel berupa semen segar dan semen beku dari delapan ekor sapi terdiri atas Brahman, Ongole, Limosin dan Simental masing-masing dua ekor dengan tiga kali koleksi dan prosesing (n=24). Sapi-sapi tersebut milik BIB Lembang dan dipelihara dengan standar BIB yang baik. Proses koleksi, evaluasi sampai
16
produksi semen beku dilakukan di BIB Lembang, sedangkan pengujian post
thawing di lakukan di URR.
Metode Penelitian Koleksi, Evaluasi dan Pengolahan Semen
Semen dikoleksi menggunakan vagina buatan dua kali seminggu. Semen segar selanjutnya dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis meliputi, volume, warna, pH dan konsistensi dan mikroskopis meliputi gerakan massa, motilitas, viabilitas, membran plasma utuh (MPU) dan tudung akrosom utuh (TAU) mengacu kepada (Arifiantini 2012).
Pengujian Kualitas Semen Segar a. Motilitas Spermatozoa
Sebanyak 10 µ L semen diambil menggunakan mikropipet diteteskan pada gelas objek dan ditambah NaCl fisiologis dengan perbandingan 1:4, dihomogenkan kemudian diambil satu tetes campuran larutan dan dipindahkan ke gelas objek lain kemudian ditutup gelas penutup. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop (Olympus CH 20) dengan perbesaran 100x dan 400x pada 10 lapangan pandang. Penilaian diberikan dalam kisaran 0-100% dengan skala 5%.
b. Viabilitas (Spermatozoa Hidup)
Sebanyak 10 µ L semen diletakkan pada gelas objek, ditambah pewarna eosin-nigrosin 50 µ L, dihomogenkan dan dibuat preparat ulas serta dikeringkan diatas meja penghangatdalam waktu 15-20 detik. Preparat diamati di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 400x, spermatozoa yang hidup tidak menyerap warna dan spermatozoa yang mati akan menyerap warna. Spermatozoa yang hidup dan mati dihitung dalam 10 lapangan pandang. Persentase spermatozoa hidup dihitung menggunakan rumus:
c. Keutuhan Membran Plasma (MPU)
Keutuhan membran plasma dievaluasi menggunakan larutan Hypoosmotic
Swelling Test (HOS). Sebanyak 10 µ L semen dimasukkan ke dalam mikrotub
berisi 1.000 µL larutan HOS (1.351 g fruktosa dan 0.735 g Na-sitrat dalam 100 mL aquadest; osmolaritas 150 mOsm), dihomogenkan. Campuran larutan tersebut disimpan pada water bath suhu 37 °C. Keutuhan membran plasma spermatozoa dilakukan 30 menit setelah inkubasi dengan cara meneteskan satu tetes campuran larutan pada gelas objek, ditutup menggunakan gelas penutup dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x, spermatozoa yang normal dan yang bereaksi terhadap larutan HOS dihitung pada 10 lapangan pandang. Perhitungan persentase spermatozoa yang beraksi terhadap larutan HOS dilakukan dengan cara :
17
d. Keutuhan Tudung Akrosom (TAU)
Satu tetes semen dimasukkan ke dalam mikrotub berisi larutan formol-saline
(2.54 g potassium dihydrogen phosphate, 5.41 g sodium chloride, 6.19 g di- sodium hydrogen phosphate dehydrate, 125 mL formaldehyde solution 37%), dan 875 ml aquadest. Semen segar dimasukkan dalam larutan formol-saline dengan perbandingan 1:100. Dibiarkan selama 1 jam dan diambil satu tetes kemudian diletakkan pada gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop fase kontras dengan perbesaran 400x. Spermatozoa yang memiliki tudung akrosom yang utuh ditandai dengan 1/2 sampai 2/3 bagian anterior kepala berwarna lebih gelap dari bagian posterior. Pemeriksaan dilakukan pada 10 lapangan pandang yang berbeda.
e. Pengujian Toluidine Blue (TB)
Satu tetes semen segar dibuat preparat ulas pada gelas objek, dikeringudarakan dan difiksasi dalam etanol 96% - aseton (1:1) selama 30 menit pada suhu 4 oC. Setelah fiksasi, preparat dikeringudarakan lalu dihidrolisis dalam HCL 0.1 N selama 5 menit pada suhu 4 oC. Preparat dibilas tiga kali menggunakan aquadest, lalu diwarnai dengan pewarnaan TB 0.05% dibiarkan selama 10 menit. Preparat yang telah diwarnai dicuci kembali dengan aquadest dan didehidrasi dengan menggunakan t-butanol dua kali serta dibersihkan dengan
xylol sebanyak dua kali. Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya dengan
pembesaran 400x. Kepala spermatozoa memiliki integritas kromatin yang baik akan berwarna biru terang, sedangkan dengan integritas kromatin yang sudah berkurang akan berwarna biru tua. Pemeriksaan dilakukan pada 100 spermatozoa untuk setiap sampel (Erenpreisa et al. 2003).
Pembekuan Semen
Semen yang memiliki motilitas spermatozoa >70% dengan konsentrasi >1000 juta/mL diproses menjadi semen beku. Proses produksi semen beku dilakukan sesuai dengan protokol BIB Lembang menggunakan bahan pengencer Skim milk egg yolk dengan konsentrasi gliserol 8% dan dikemas dalam ministraw 0.25 mL dengan dosis inseminasi 25 juta/straw. Semen beku yang telah diproduksi disimpan dalam kontainer nitrogen cair (-196 oC) sampai pengujian lebih lanjut. Pengujian semen beku dilakukan dengan cara melakukan thawing
semen beku terlebih dahulu. Semen beku di-thawing pada air suhu 37 oC selama 30 detik. Semen yang telah di-thawing dimasukkan ke dalam mikrotub dan dievaluasi terhadap motilitas, viabilitas, MPU, TAU dan keutuhan DNA. Prosedur pengujian semen beku sebagai berikut ;
18
Pengujian Kualitas Semen beku a. Motilitas Spermatozoa
Sebanyak 10 µ L semen diambil menggunakan mikrotub diteteskan pada gelas objek yang telah dihangatkan kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop perbesaran100X dan 400X pada 10 lapang pandang. Penilaian diberikan dalam kisaran 0-100%.
b. Viabilitas (Spermatozoa Hidup)
Sebanyak 10 µ L semen diletakkan pada gelas objek, ditambah pewarna Eosin-Nigrosin 20 µ L, dihomogenkan dan dibuat preparat ulas dari campuran tersebut dalam waktu 15 detik, dan dikeringkan diatas meja penghangat hingga kering. Preparat diamati di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 400X. Spermatozoa yang hidup tidak menyerap warna dan spermatozoa yang mati akan menyerap warna. Spermatozoa yang hidup dan mati dihitung dalam 10 lapang pandang. Persentase spermatozoa hidup dihitung menggunakan rumus:
c. Keutuhan Membran Plasma (MPU)
Keutuhan membran plasma dievaluasi menggunakan larutan Hypoosmotic
Swelling Test (HOS). Sebanyak 50 µ L semen dimasukkan ke dalam mikrotub
yang berisi larutan HOS dan dihomogenkan. Campuran larutan tersebut dan simpan pada pada water bath suhu 37 °C. Pemeriksaan MPU semen beku dilakukan setelah 30 menit inkubasi dengan cara meneteskan satu tetes campuran larutan pada sebuah gelas objek, kemudian ditutup menggunakan gelas penutup dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400X, spermatozoa yang normal dan yang bereaksi dihitung pada pada 10 lapang pandang. Perhitungan persentase spermatozoa yang beraksi dilakukan dengan cara :
d. Keutuhan Tudung Akrosom (TAU)
Satu tetes semen dimasukkan ke dalam tabung mikrotub yang berisi larutan formol-saline. Satu tetes campuran semen segar atau semen beku dengan larutan formol-saline diletakkan pada gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400X. Spermatozoa dievaluasi satu persatu dengan memainkan fokus. Spermatozoa yang memiliki tudung akrosom yang utuh pada bagian anterior kepala berwarna lebih gelap (abu-abu). Pemeriksaan dilakukan pada 10 lapang pandang yang berbeda.
19
e. Pengujian Toluidine Blue (TB)
Semen segar diambil satu tetes dan dibuat preparat ulas, pada 4 buah gelas objek. Preparat selanjutnya dikeringudarakan dan difiksasi di dalam etanol 96% - aseton (1:1) selama 30 menit pada suhu 4 oC. Setelah difiksasi, preparat dikering udarakan, selanjutnya dihidrolisis di dalam HCL 0.1 N selama 5 menit pada suhu 4 oC. selanjutnya preparat dibilas tiga kali menggunakan aquadest.
Preparat selanjutnya diwarnai dengan pewarnaan TB 0.05% selama 10 menit. Preparat yang telah diwarnai dicuci kembali dengan aquadest dan didehidrasi dengan menggunakan t-butanol dua kali serta dibersihkan menggunakan xylol sebanyak dua kali. Preparat kemudian ditutup dengan gelas penutup dan diamati dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 X. Kepala spermatozoa yang integritas kromatinnya masih baik akan berwarna biru terang, sedangkan spermatozoa yang integritas kromatinnya sudah berkurang akan berwarna biru tua. Pemeriksaan dilakukan terhadap 100 spermatozoa untuk setiap sample (Erenpreisa et al. 2003).
f. Pengujian DNA dengan Kit Halomax® yang dimodifikasi
Urutan pemeriksaan kerusakan DNA spermatozoa sapi menggunakan Kit Halomax® sebagai berikut ;
1. Encerkan semen dengan konsentrasi akhir 15-20 juta sel /mL dalam
Phosphate Buffered Saline (PBS).
2. Lelehkan agarose dalam water bath (90 °C-100 °C) selama 5 menit 3. Inkubasi agarose pada suhu 37 °C selama 5 menit.
4. Ambil 25 μL semen dan masukkan dalam agarose (mixing).
5. Suspensi semen (no.4) dimasukkan dalam gelas objek sebanyak 25μL, kemudian tutup dengan gelas penutup.
6. Inkubasi preparat dalam kulkas selama 5 menit.
7. Angkat perlahan gelas penutup kemudian teteskan dengan Lysis
Solution (LS) hingga agarose terendam, inkubasi pada suhu ruang
selama 5 menit.
8. Preparat diinkubasi dalam aquadest selama 5 menit.
9. Inkubasi preparat dalam etanol 70%, 90%, 100% (masing-masing dalam waktu 4 menit).
10.Keringanginkan preparat.
11.Preparat diinkubasi dalam aquadest selama 5 menit, kemudian keringanginkan.
12.Staining preparat: Inkubasi preparat dalam kotak berisi pewarna Eosin
selama 5 menit, kemudian cuci menggunakan aquadest dalam kotak selama 2 menit. Inkubasi preparat dalam kotak berisi pewarna
Methylene Blue selama 5 menit kemudian cuci menggunakan aquadest
dalam kotak selama 2 menit.
13.Amati preparat di bawah mikroskop perbesaran 400x dengan menggunakan green filter. Pemeriksaan dilakukan terhadap 100 spermatozoa untuk setiap sampel.
20
Analisis Data
Penelitian ini dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Sampel berupa semen segar dan semen beku berasal dari delapan ekor sapi terdiri atas Brahman, Ongole, Limosin dan Simental masing-masing dua ekor dengan tiga kali koleksi dan prosesing (n=24). Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji one sample t test dengan bantuan program sotfware SPSS 16
for windows dan Microsoft excel. Data disampaikan dalam rataan dan standar
deviasi.
