Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari sampai Maret 2014. Kegiatan ekstraksi daun mahkota dewa akan dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara dan uji efektivitas antibakteri terhadap A. hydrophila akan dilakukan di Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan II, sedangkan untuk uji LC50 48 jam akan dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah cawan petri, laminar air flow, pipet tetes, gelas ukur, tabung reaksi, botol vial, beaker glass, rak tabung, inkubator, jarum ose, rotary evaporator, labu erlenmeyer, blender, kertas saring, pipet tetes, spreader,
refrigerator, oven, timbangan analitik, autoklaf, vortex, hot plate, pinset, magnetic stirrer, akuarium ukuran 60 x 40 x 30 sebanyak 19 buah, aerator sebanyak 20 buah, DO meter, termometer, dan pH meter.
Bahan yang digunakan adalah daun mahkota dewa, Isolat Murni Bakteri A. hydrophila yang diperoleh dari Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan I, Trypticase soy agar (TSA), larutan FeCl3 1%, Pereaksi Bouchardat, Pereaksi Wagner, Pereaksi Mayer, Pereaksi Dragendroff, Larutan 0,5 Mc. Farland, Larutan CeSO4, Plat Thim Layer Cromatography (TLC), aquades, alkohol 70%, metanol, NaCl 0,9% kertas label,
kertas cakram, kapas, alumunium foil, dan benih ikan gurami berukuran 4-6 cm sebanyak 150 ekor. Gambar Alat dan Bahan dapat dilihat pada Lampiran 1.
Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan menguji cobakan secara langsung konsentrasi ekstrak daun mahkota dewa terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila. Untuk mengetahui pengaruh daya hambat ekstrak daun mahkota dewa terhadap pertumbuhan bakteri, maka digunakan rancangan percobaan acak lengkap dengan 6 perlakuan yakni A. Tanpa perlakuan 0% (Kontrol), B. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 2,0%, C. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 4,0%, D. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 6,0% , E. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 8,0%, dengan masing-masing sebanyak 2 kali ulangan. Parameter yang diukur adalah luas daerah hambat yaitu daerah bening yang terbentuk di sekitar cakram setelah diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37oC.
Selanjutnya dilakukan uji LC50 48 jam menguji cobakan secara langsung konsentrasi ekstrak daun mahkota dewa terhadap benih ikan gurami 4 perlakuan yakni A. Tanpa perlakuan 0 ppm (Kontrol), B. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 250 ppm, C. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 500 ppm, D. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 600 ppm, dan E. Perlakuan Ekstrak daun mahkota dewa 750 ppm dengan masing-masing sebanyak 3 kali ulangan. Parameter yang diamati adalah jumlah mortalitas benih ikan gurami terhadap konsentrasi ekstrak daun mahkota dewa yang berbeda dengan tetap menjaga kualitas air tempat hidup ikan uji.
Prosedur Penelitian
Pembuatan Ekstrak Daun Mahkota dewa
Daun Mahkota dewa segar dicuci dengan menggunakan air bersih. Kemudian daun mahkota dewa dikering-anginkan. Daun mahkota dewa yang sudah kering diblender sehingga diperoleh bubuk kering. Daun Mahkota dewa tersebut kemudian dimasukkan ke dalam maserator dan diisi dengan metanol. Maserasi dilakukan selama 2 x 24 jam. Selanjutnya hasilnya (filtrat ekstrak metanol) disaring dengan menggunakan kertas saring dan ditampung dalam erlenmeyer sehingga diperoleh filtrat ekstrak metanol yang bebas dari kotoran. Filtrat ekstrak etanol kemudian dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40 0C dengan kecepatan 120 rpm sampai tidak terjadi lagi pengembunan pelarut pada kondensor (Rosidah dan Afiziah, 2012).
Uji Fitokimia Daun Mahkota Dewa
Uji fitokimia daun mahkota dewa merupakan uji yang dilakukan untuk mengetahui senyawa-senyawa kimia yang terdapat di dalamnya. Tahapan pengujian saponin, steroid/terpenoid, alkaloid dan fenolik dilakukan berdasarkan metode Harborne (1998) dan pengujian glikosida berasarkan metode Medika Indonesia tahun 1995.
Simplisia sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer yang telah berisi pelarut metanol 100 ml kemudian diaduk dan direndam selama 24 jam.
a. Pengujian golongan fenolik
Ekstrak sampel diambi 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah FeCl3 1% jika terjadi perubahan warna menjadi hitam maka positif terdapat senyawa fenolik.
b. Pengujian golongan alkaloid
Ekstrak sampel diambil 4 ml dimasukkan masing-masing 1 ml kedalam 4 tabung reaksi. Tabung pertama ditambah 2 tetes pereaksi Bouchardat, apabila terbentuk endapan berwarna cokelat sampai hitam maka sample positif alkaloid. Tabung kedua ditambah 2 tetes pereaksi Dragendroff, apabila terbentuk endapan berwarna merah/jingga maka sampel positif alkaloid. Tabung ketiga ditambah 2 tetes pereaksi Mayer, apabila terbentuk endapan berwarna putih/kuning maka sampel positif alkaloid. Tabung keempat ditambah 2 tetes pereaksi Wagner, apabila terbentuk endapan berwarna cokelat maka sampel positif alkaloid.
c. Pengujian golongan terpenoid/steroid
Ekstrak diambil sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 tetes pereaksi Lieberman-Bouchard. Apabila terbentuk warna biru/hijau menunjukkan adanya terpenoid/steroid.
Pengujian dengan CeSO4 dilakukan dengan metode Thin Layer Cromatography (TLC) dengan cara ekstrak sampel diteteskan ke plat TLC kemudian disemprot dengan pereaksi CeSO4 dan dipanaskan di atas hot plate. Perubahan warna yang terjadi di plat diamati dan dibandingkan dengan standar tripenoid dan β-sitosterol yang terbentuk.
d. Pengujian golongan saponin
Setelah 24 jam ampas dari proses maserasi diambil dengan spatula sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml aquades. Tabung reaksi dikocok hingga muncul buih. Ekstrak diberi 1 tetes HCl, bila buih terbentuk ± 10 menit maka positif terdapat senyawa saponin.
e. Pengujian flavonoid
Ekstrak sampel diambil 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah FeCl3 1% jika terjadi perubahan warna menjadi merah jingga maka positif terdapat senyawa fenolik.
Uji In vitro Sterilisasi Alat
Sebelum melakukan pengujian, alat dan bahan disterilisasi dengan tujuan membersihkan atau membebaskan alat dan bahan dari mikroorganisme. Alat-alat yang akan disterilisasi dicuci terlebih dahulu dengan menggunakan detergen setelah itu dikeringkan. Sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf, cawan petri dibungkus dengan kertas sampul dan tabung reaksi ditutup dengan kapas, kemudian dibungkus dengan kertas dan diikat. Alat dimasukkan ke dalam autoklaf, kemudian autoklaf dihidupkan dengan suhu 121 °C selama 20 menit setelah selesai autoklaf dibuka dan semua alat dipindahkan (Barus, dkk. 2013).
Pengenceran ekstrak daun Mahkota dewa
Pengenceran ekstrak daun Mahkota dewa dilakukan dengan melarutkan ekstrak daun Mahkota dewa dengan aquades kedalam wadah berupa botol vial sesuai dengan konsentrasi tiap perlakuan yaitu A. Tanpa perlakuan 0% (Kontrol), B. Perlakuan ekstrak daun mahkota dewa 2,0% (0,2 gram ekstrak daun mahkota
dewa dilarutkan dengan 2 ml aquades), C. Perlakuan ekstrak daun mahkota dewa 4,0% (0,4 gram ekstrak daun mahkota dewa dilarutkan dengan 4 ml aquades), D. Perlakuan ekstrak daun mahkota dewa 6,0% (0,6 gram ekstrak daun mahkota dewa dilarutkan dengan 6 ml aquades), E. Perlakuan ekstrak daun mahkota dewa 8,0% (0,8 gram ekstrak daun mahkota dewa dilarutkan dengan 8 ml aquades).
Pembuatan Media
Media TSA 10 gram ditimbang dan dilarutkan dengan 250 ml aquades dalam Erlenmeyer dan dipanaskan di atas hot plate sambil di aduk menggunakan
magnetik stirrer. Selanjutnya media didinginkan, lalu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan dibalut alumunium foil. Selanjutnya Erlenmeyer tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah selesai media TSA dituang ke dalam petridisk di dalam Laminar air flow agar tidak terjadi kontaminasi (Barus, dkk., 2013).
Pembuatan Agar Miring
Ke dalam tabung reaksi steril dimasukkan 3 ml media TSA steril, didiamkan hingga memadat pada posisi miring kira-kira 450 (Ditjen POM diacu oleh Mierza, 2011).
Peremajaan Biakan Murni
Bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media TSA miring dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri A. hydrophila kemudian diinkubasi selama 18 24 jam pada suhu 36 -370C dalam inkubator (Ditjen POM diacu oleh Mierza, 2011).
Pembuatan Larutan Suspensi
Pembuatan suspensi dilakukan dengan cara mengambil 1 sampai 2 jarum ose A. hydrophila yang dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9% selanjutnya dihomogenkan dengan vortex. Kemudian, kekeruhan suspensi tersebut dibandingkan dengan larutan standar 0,5 McFarland secara berdampingan dengan latar belakang garis-garis bewarna hitam menggunakan mata tanpa bantuan alat. Bila kekeruhan suspensi tersebut tidak cocok dengan turbiditas larutan standar maka dapat ditambahkan koloni A. hydrophila pada suspensi atau mengencerkan suspensi tersebut dengan menambahkan NaCl 0,9% (Barus, dkk. 2013).
Penanaman Bakteri
Penanaman Bakteri menggunakan metode cawan sebar (spread plate) . Pada metode cawan sebar, 1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media TSA yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan petri disebarkan dengan spreader pada suhu (370C) selama 1-2 hari (Barus, dkk., 2013).
Uji daya hambat ekstrak daun Mahkota dewa
Kertas cakram (diameter 5 mm) diresapkan dalam larutan ekstrak. Kertas cakram tersebut kemudian diletakkan di atas permukaan media bakteri menggunakan pinset dan ditekan sedikit. Media bakteri yang sudah dipasangi bahan antibakteri diinkubasi pada suhu 370C selama 18-24 jam. Pembacaan awal dapat dilakukan setelah 6-8 jam. Diameter zona hambatan yang terbentuk diukur menggunakan jangka sorong (Barus, dkk. 2013).
Uji LC50 48 Jam Persiapan Wadah
Akuarium dengan ukuran 60 x 40 x 30 yang telah disediakan dicuci bersih dan dikeringkan. Selanjutnya akuarium diisi air sebanyak 10 liter. Akuarium tersebut dilengkapi dengan aerator.
Peletakkan Benih Ikan Gurami
Setelah dilakukan persiapan wadah, selanjutnya dimasukkan 10 ekor benih ikan gurami ke dalam tiap akuarium yang tersedia dibiarkan beradaptasi selama 1 hari.
Pembuatan Larutan Induk
Pembuatan larutan induk dilakukan dengan melarutkan ekstrak daun mahkota dewa kedalam air. Uji pengenceran berdasarkan rumus
(dengan V1 adalah volume air media yang akan digunakan,N1 adalah konsentrasi ekstrak daun mahkota dewa dalam stok,V2 adalah volume larutan standar yang digunakan, dan N2 adalah konsentrasi ekstrak daun mahkota dewa yang digunakan), dengan konsentrasi yang berbeda sebagai perlakuan, yakni A. Tanpa perlakuan 0 ppm (Kontrol) (0 mg/l), B. Perlakuan Ekstrak daun Mahkota dewa 250 ppm (250 mg/l), C. Perlakuan Ekstrak daun Mahkota dewa 500 ppm (500 mg/l), D. Perlakuan Ekstrak daun Mahkota dewa 600 ppm (600 mg/l), dan E. Perlakuan Ekstrak daun Mahkota dewa 750 ppm (750 mg/l), selanjutnya dihasilkan volume larutan induk dengan konsentrasi yang berbeda yakni A. 0 liter (Kontrol), B. 2,5 liter, C. 5 liter, D. 6 liter dan D. 7,5 liter, dan jika dijumlahkan menghasilkan 21 liter larutan induk (dari 21 liter air dimasukkan 21 gram ekstrak
mahkota dewa). Setiap perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan sehingga total air yang digunakan adalah 63 liter.
Pencampuran larutan ekstrak daun Mahkota dewa ke dalam wadah
Pada tahap ini, dilakukan pengurangan volume air di tiap-tiap akuarium sesuai terhadap volume larutan induk ekstrak dengan konsentrasi yang berbeda sebagai perlakuan yakni Akuarium perlakuan A. 10 liter – 0 liter = 10 liter; Akuarium perlakuan B. 10 liter – 2,5 liter = 7,5 liter; Akuarium perlakuan C. 10 liter – 5 liter = 5 liter; Akuarium perlakuan D. 10 liter – 6 liter = 4 liter; dan Akuarium perlakuan E. 10 liter – 7,5 liter = 2,5 liter. Selanjutnya dilakukan proses pencampuran larutan induk sesuai konsentrasi kedalam tiap-tiap akuarium yakni Akuarium perlakuan A. 10 liter air akuarium + 0 liter larutan induk = 10 liter; Akuarium perlakuan B. 7,5 liter air akuarium + 2,5 liter larutan induk = 10 liter; Akuarium perlakuan C. 5 liter air akuarium + 5 liter larutan induk ekstrak = 10 liter; Akuarium perlakuan D. 4 liter + 6 liter = 10 liter; dan Akuarium perlakuan E. 2,5 liter + 7,5 liter = 10 liter. Uji LC50 48 jam ini dilakukan masing-masing sebanyak 3 ulangan.
Pengamatan Kualitas Air
Untuk menjaga kualitas air selama percobaan dilakukan penyiponan setiap hari. Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu, DO, dan pH. Pengukuran dilakukan setiap hari, pagi dan sore. Dokumentasi kegiatan penelitian dapat dilihat pada Lampiran 2.
Parameter yang diamati
1. Zona Hambat Pertumbuhan Bakteri
Parameter yang diukur adalah luas zona hambat yaitu zona bening yang terbentuk di sekitar cakram setelah diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperature 370C.
2. Mortalitas Benih Ikan Gurami
Mortalitas benih ikan gurami diamati setelah dilakukan perendaman dalam larutan ekstrak daun Mahkota dewa dengan berbagai konsentrasi selama 48 jam pada jam ke-0, 6, 12, 24, dan 48.
3. Kualitas air
Pengamatan kualitas air meliputi suhu, DO, dan pH yang dilakukan setiap hari, pada pagi dan sore.
Analisis Data
Untuk zona hambat, analisis data menggunakan ANOVA, dan apabila terdapat perbedaan yang nyata dilakukan uji BNT. Selanjutnya untuk analisis data uji LC50 48 jam dengan menggunakan software Analisis EPA Probit.