Tikus percobaan diadaptasikan selama 6 hari dengan tujuan menghilangkan terjadinya stres akibat perjalanan dan perpindahan ke lingkungan baru. Ke-25 ekor tikus dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu :
1. Kelompok K (-) atau kontrol negatif, tikus pada kelompok ini tidak disuntik dengan aloksan.
2. Kelompok K (+) atau kontrol positif, tikus pada kelompok ini disuntik dengan aloksan dan dicekok aquadest (5 ml).
3. Kelompok VCO A, tikus pada kelompok ini disuntik dengan aloksan dan dicekok VCO A (5 ml).
4. Kelompok VCO B, tikus pada kelompok ini disuntik dengan aloksan dan dicekok VCO B (5ml).
5. Kelompok minyak goreng (MG), tikus pada kelompok ini disuntik dengan aloksan dan dicekok minyak goreng (5ml).
Setiap kelompok diberi perlakuan selama 28 hari. Kadar glukosa darah diukur menggunakan glukometer sehari sebelum dan dua hari sesudah penginduksian aloksan, kemudian dilanjutkan dengan pengukuran rutin kadar glukosa darah setiap empat hari. Pengambilan sampel (sampling) terhadap organ ginjal dilakukan diakhir perlakuan, lalu difiksasi, dehidrasi, penjernihan
(clearing), infiltrasi parafin, penanaman jaringan (embedding), penyayatan
(sectioning), pewarnaan (staining) HE dan imunohistokimia Cu,Zn-SOD,
perlekatan sediaan (mounting), dan pembuatan fotomikograf.
Pembuatan Tikus Diabetes Mellitus
Untuk membuat tikus diabetes mellitus tipe 1 dilakukan penginduksian alloxan sehingga tikus mengalami keadaan hiperglikemia. Tikus yang telah diadaptasikan selama 6 hari dipuasakan selama semalam. Sebelum diinduksi alloxan berat badan tikus ditimbang untuk menghitung dosis alloxan dengan dosis 110 mg/Kg berat badan. Tikus diinjeksi aloksan secara intraperitoneal. Dua hari setelah diinduksi glukosa darah tikus diukur dengan menggunakan glukometer. Pengukuran glukosa darah memerlukan darah tikus yang didapatkan dari penusukan pembuluh darah pada ekor tikus bagian ujung. Tikus dengan kadar glukosa darah di atas 200 mg/dL dinyatakan menderita diabetes.
Pengambilan Sampel (Sampling) dan Fiksasi
Pengambilan sampel ginjal dilakukan setelah tikus diberi perlakuan selama 28 hari. Larutan bouin yang terdiri dari larutan asam pikrat jenuh, formalin (37% - 40%), dan asam asetat glasial disiapkan terlebih dahulu dengan perbandingan 15 : 5 : 1. Tikus dimatikan dengan cara cervicalis dislocasio lalu abdomen tikus dibedah dan organ ginjal diambil dengan sangat hati-hati untuk menghindari kerusakan jaringan. Sampel ginjal langsung direndam dengan larutan Bouin yang telah diberi label dan catatan waktu masuknya sampel ke dalam larutan. Organ ginjal difiksasi dalam larutan Bouin selama 24 jam kemudian larutan Bouin diganti dengan alkohol 70% (stopping point).
Dehidrasi
Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan seri alkohol bertingkat yaitu alkohol 70%, alkohol 80% , alkohol 90% , alkohol 95% (masing-masing 24 jam), alkohol absolut I (100%), alkohol absolut II, alkohol absolut III (masing-masing 1 jam)
Penjernihan(Clearing)
Penjernihan bertujuan menggantikan tempat etanol dalam jaringan dan reagen yang dipergunakan adalah xylol. Sediaan/jaringan dipindahkan dari alkohol absolut III ke larutan penjernih (xylol), pemaparan dilakukan dalam xylol I (1 jam), xylol II (1 jam), xylol III (suhu kamar 30 menit), xylol IV (inkubator 30 menit).
Infiltrasi parafin
Infiltrasi parafin bertujuan untuk menggantikan kedudukan dehidran dalam jaringan dan bahan penjernih dengan parafin jaringan dimasukan dalam parafin I, parafin II, parafin III (masing-masing 1 jam)
Penanaman jaringan (Embedding)
Bahan dan alat yang digunakan dalam proses ini adalah inkubator,
embedding tissue console, pinset, parafin cair, gliserin, blok kayu, pinset, pemanas bunsen, tutup pagoda, spatula, dan kertas film (untuk label).
Tahap pertama tutup pagoda diolesi gliserin dan tetap dalam kondisi hangat (pengerjaan dilakukan di atas hot plate bersuhu 67ºC), kemudian menggunakan embedding tissue console parafin cair dituangkan ke dalam tutup pagoda perlahan-lahan. Jaringan secara hati-hati diletakkan ke dalam parafin dengan menggunakan pinset. Kemudian letaknya diatur sesuai dengan posisinya terhadap jaringan yang lain untuk mempermudah proses pemotongan, kemudian parafin ditambahkan lagi sampai permukaan cembung. Pada setiap sampel dituliskan nama sampelnya menggunakan pinsil di atas kertas film.
Setelah jaringan ditanam tutup pagoda dipindahkan dari keadaan hangat ke bagian dingin (cold plate) untuk beberapa saat agar membeku lalu dipindahkan ke
dalam air sampai parafin membeku sempurna dan jika parafin telah membeku sempurna, parafin dikeluarkan dari pagoda dengan cara mengungkit salah satu sisi pagoda dengan pisau. Potongan parafin yang membungkus jaringan ditrimming
sampai membentuk kotak lalu ditempelkan pada balok kayu yang telah disediakan.
Pembuatan blok jaringan
Pisau dipanaskan di atas pemanas bunsen dan parafin di sekitar sampel dirapikan dengan cara dipotong. Kayu tempat penempelan sampel diletakkan pada alas agar statis. Pemotongan parafin diletakkan di atas blok kayu. Kemudian pisau dipanaskan dan diletakan di atas parafin sampai cair. Sampel diletakkan di atas pisau panas dan secara perlahan diletakan di kayu yang telah dialasi parafin cair. Sampel telah siap untuk dipotong, blok parafin bisa disimpan dalam lemari es sebelum dipotong menggunakan mikrotom.
Penyayatan(Sectioning)
Blok parafin dipasang pada mikrotom dan diatur agar posisinya sejajar dengan posisi pisau. Blok parafin dipotong dengan ketebalan 5µm. Pada awal pemotongan dilakukan trimming karena jaringan yang terpotong masih belum sempurna. Setelah didapatkan hasil sayatan yang terbaik, hasilnya diambil dengan kertas yang basah pada bagian ujung lalu diapungkan di atas air dingin. Jika hasil potongan membentuk pita maka jaringan dipisahkan dengan jarum satu persatu. Potongan jaringan yang telah terpisah ditempatkan pada air hangat dengan suhu 37ºC untuk menghilangkan kerutan lalu ditempatkan pada gelas objek. Sediaan pada gelas objek lalu dilihat di bawah mikroskop untuk melihat kesempurnaannya jika belum maka dicari potongan lain. Gelas objek dengan sediaan jaringan sempurna diberi label sesuai dengan perlakuan dan dikeringkan. Sediaan disimpan pada inkubator dengan suhu 37ºC selama semalam lalu siap untuk diwarnai dengan pewarnaan HE. Untuk pewarnaan imunohistokimia gelas objek dilem dulu dengan neofren. Sebelum pengeleman, gelas objek disterilkan dahulu dengan ultrasonic cleaner menggunakan larutan alkohol 70% (20 menit), kemudian secara berurutan dipindahkan ke dalam distiled water 1 (DW1), DW2,
dan DW3 (masing-masing selama 20 menit). Setiap pergantian, DW yang telah dipakai harus diganti dengan yang baru kemudian gelas objek yang telah steril disimpan dalam inkubator dengan suhu 37ºC selama semalam lalu dilem dengan neofren.
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) (Kiernan, 1990)
Pewarnaan HE diawali dengan deparafinisasi yang bertujuan menghilangkan parafin pada jaringan. Proses penarikan parafin dengan seri xylol III (3 menit), xylol II (3 menit), xylol I (5 menit). Langkah selanjutnya adalah rehidrasi menggunakan alkohol untuk mengembalikan kandungan air jaringan, prosesnya dilakukan dengan mencelupkan sediaan dalam serial larutan alkohol 95 %, alkohol 90 %, alkohol 80 % (masing-masing 3 menit), alkohol 70 % (5 menit), air keran (10 menit) dan aquadest (10 menit).
Jaringan lalu dimasukkan ke dalam larutan pewarna hematoksilin selama 12 detik untuk mewarnai inti sel. Sediaan kembali diletakkan dalam air keran selama 5 menit selanjutnya aquadest 5 menit. Dilanjutkan dengan pewarnaan eosin selama 4 menit untuk mewarnai sitoplasma jaringan. Sediaan dibilas kembali dengan aqudest selama 5 menit.
Tahap berikutnya adalah dehidrasi. Sediaan dicelup-celupkan sebanyak 2-3 kali secara berurutan ke dalam larutan alkohol 70 %, 80 %, 90 %, 95%, dan alkohol absolut I, selanjutnya alkohol absolut II (1 menit) dan alkohol absolute III (1 menit). Proses terakhir adalah penjernihan (clearing) dengan memindahkan jaringan dari alkohol absolut III ke xylol I (1 menit), xylol II (1 menit) dan xylol III (3 menit)
Pewarnaan Immunohistokimia (Wresdiyati et al., 2002)
Proses pewarnaan immunohistokimia diawali deparafinisasi dan rehidrasi seperti pada pewarnaan HE. Selanjutnya dilakukan penghilangan aktivitas enzim peroksidase endogen dalam gelap (0,3 ml H2O2 dalam methanol 30 ml) dalam suhu ruang dicelup selama 15 menit. Sediaan dicuci dengan distiled water (DW) sebanyak dua kali masing-masing 10 menit kemudian dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS) sebanyak dua kali masing-masing 10 menit.
Sediaan ditetesi normal serum, diinkubasi pada suhu 37ºC selama 60 menit dan dicuci kembali dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit selanjutnya diinkubasi dalam antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD (Sigma S2147) sebanyak 70 µl per sediaan pada suhu 4ºC selama 2 malam. Sediaan dicuci lagi dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing selama 10 menit. Berikutnya diinkubasi dalam antibodi sekunder menggunakan DEPS ( Dako Envision Peroksidase System) sebanyak 70µl per sediaan pada suhu 37ºC selama 60 menit. Sediaan dicuci lagi dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit.
Sediaan divisualisasi dengan DAB kit selama 25 menit ditutup dalam ruang gelap, lalu dimasukkan dalam DW sebagai stopping point kemudian
counterstain dengan Hematoksilin. Terakhir dilakukan dehidrasi, clearing, dan
mounting.
Penutupan (Mounting)
Penutupan sediaan dilakukan setelah proses selesai dengan menggunakan entelan sebagai perekat. Sediaan yang telah diclearing diletakkan di atas kertas
tissue dan pada sisi yang ada jaringannya dibiarkan basah. Bahan entelan diteteskan secukupnya di atas sediaan dan dengan pinset diletakkan cover glass
secara hati-hati untuk menghindari gelembung udara. Dibiarkan sampai kering.
Pemotretan(microphotography)
Bagian sediaan yang akan difoto dicari dengan menggunakan mikroskop cahaya kemudian ditandai. Sediaan yang telah ditandai siap untuk difoto. Pemotretan dilakukan dengan mikroskop foto (Nikon E 600). Pengamatan sediaan dengan menggunakan lensa okuler mikroskop, sesuai perbesaran dan diafragmanya. Setelah dicek menggunakan lensa okuler, kamera diatur lagi fokusnya. Bila kondisi sudah optimum sediaan siap difoto. Pada saat pemotretan dilakukan juga pencatatan mengenai jenis sediaan, perbesaran, antigen-antibodi serta data-data lain mengenai film, mikroskop, kamera dan sebagainya. Setiap sediaan difoto sebanyak 5 kali/lapang pandang. Untuk pemuatan skala mikrograf juga dilakukan pemotretan skala mikrometer.
Pengamatan dan Analisa data
Pengamatan dilakukan terhadap jaringan ginjal yang telah diwarnai dengan HE menggunakan mikroskop cahaya (Olympus CH-20) dan didokumentasikan dengan mikroskop foto (Nikon E600). Pengamatan dilakukan terhadap morfologi umum dari masing-masing perlakuan. Hasil pewarnaan immunohistokimia diamati terhadap kandungan Cu,Zn SOD (warna coklat) pada sel-sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan dari masing-masing perlakuan. Pengamatan dilakukan secara kualitatif, kuantitatif, dan persentase.
Pengamatan secara kualitatif dilakukan pada seluruh bagian ginjal yaitu pada glomerulus, inti dan sitoplasma sel tubuli ginjal. Pengamatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi pada berbagai tingkatan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal tikus yang diamati. Untuk melihat perbedaan reaksi tersebut penghitungan dibagi menjadi tiga tingkatan intensitas warna untuk reaksi positif dan satu warna untuk untuk reaksi negatif. Reaksi positif terdiri dari positif kuat yang ditunjukan dengan warna coklat tua (+++), positif sedang yang ditunjukan dengan warna coklat muda (++), dan positif lemah yang ditunjukan dengan warna coklat campur biru (+). Sel yang bereaksi negatif berarti tidak memiliki kandungan Cu,Zn-SOD dan ditunjukkan dengan warna biru (-). Penghitungan dilakukan pada lima lapang pandang pada setiap preparat yang kemudian dirata-ratakan. Kandungan Cu,Zn-SOD juga dilihat dari persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD dari masing-masing perlakuan.
Hasil pengamatan terhadap kandungan Cu,Zn-SOD secara kuantitatif (per lapang pandang) kemudian dianalisis dengan analisa sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjutan –Duncan.
HASIL Morfologi ginjal
Morfologi jaringan ginjal tikus diamati dan dibandingkan dengan menggunakan pewarnaan HE (Hematoksilin-Eosin). Hematoksilin merupakan zat warna yang bersifat basa dan berfungsi untuk mewarnai inti sel yang bersifat asam sedangkan eosin adalah zat warna yang bersifat asam dan berfungsi untuk mewarnai sitoplasma sel yang bersifat basa (Banks, 1993).
Jaringan ginjal pada kelompok K+ dan MG menunjukkan beberapa sel tubuli renalis mengalami degenerasi hingga nekrosa. Beberapa sel tubuli mengalami hipertropi dan membran sel berwarna lebih pucat dan terdapat vakuola. Peradangan juga dialami pada jaringan yang ditandai dengan ditemukannya sel-sel radang di bagian interstitial sel.
Jaringan ginjal pada kelompok VA dan VB juga menunjukkan adanya sel tubuli renalis yang mengalami degenerasi hingga nekrosa tapi jumlahnya lebih sedikit dibandingkan pada kelompok K+ dan MG. Gambaran morfologi jaringan ginjal kelompok K- menunjukan sel-sel yang mengalami degenerasi hingga nekrosa masih dalam batas yang normal karena kelompok ini tidak diinduksi dengan aloksan.
Profil antioksidan Cu,Zn-SOD
Untuk mengetahui kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal dilakukan pewarnaan immunohistokimia. Jaringan akan bereaksi positif jika ada kandungan Cu,Zn-SOD dengan memperlihatkan warna coklat sedangkan reaksi negatif ditunjukan dengan warna biru pada inti sel dan sitoplasma.
Hasil pengamatan Cu,Zn-SOD disajikan secara kualitatif, kuantitatif, dan persentase jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD. Secara kualitatif pengamatan dilakukan dengan membandingkan intensitas warna yang diberikan oleh inti dan sitoplasma sedangkan pengamatan kuantitatif dilakukan dengan cara menghitung jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD. Penghitungan persentase didasarkan pada jumlah berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD berbanding jumlah keseluruhan inti sel tubuli renalis pada tiap kelompok.
Gambar 1. Fotomikrograf jaringan ginjal tikus perlakuan K- : kontrol negatif ; K+ : kontrol positif (perlakuan diabetes); VA : VCO A (tanpa pemanasan) + perlakuan diabetes; VB : VCO B (pemanasan bertahap) + perlakuan diabetes; MG : minyak goreng + perlakuan diabetes; g : glomerulus ; tp : tubulus proksimalis ; td : tubulus distalis. Pewarnaan HE skala 50 µm
Gambar 2. Fotomikrograf jaringan ginjal tikus perlakuan K-: kontrol negatif ; K+: kontrol positif (perlakuan diabetes); VA: VCO A (tanpa pemanasan) + perlakuan diabetes; VB: VCO B (pemanasan bertahap) + perlakuan diabetes; MG: minyak goreng + perlakuan diabetes; g : glomerulus ; tp : tubulus proksimalis ; td : tubulus distalis. Pewarnaan imunohistokimia skala 50 µm.
a) Pengamatan kualitatif
Secara kualitatif kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan tikus diamati dengan melihat perbedaan intensitas warna coklat dan biru pada inti dan sitoplasma sel tubuli renalis. Keberadaan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal dilakukan dengan pemberian nilai (+) pada jaringan kelompok yang diamati. Kelompok dengan nilai (+) terbanyak berarti memiliki kandungan Cu,Zn-SOD yang paling tinggi. Pengamatan secara kualitatif ini dilakukan pada jaringan ginjal bagian glomerulus, tubuli distalis, dan tubuli proksimalis. Perbedaan kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Distribusi dan frekuensi Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal tikus Distribusi dan frekuensi Cu,Zn-SOD
kelompok Glomerulus T.distalis T.proksimalis
K- ++ ++++ ++++
K+ +/- + +/-
VA ++ ++++ ++
VB ++ +++ ++
MG +/- +
+/-Keterangan : (+) adanya kandungan SOD pada jaringan, (/) : Kandungan Cu,Zn-SOD berada diantara dua nilai.
Hasil pengamatan secara kualitatif menunjukan bahwa kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal kelompok K+ dan kelompok MG lebih redah dibandingkan kelompok K-. Kelompok perlakuan VA dan VB menunjukan kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok K+ dan MG. Kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok perlakuan VA lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok K+ dan MG, terlihat pada sel tubuli distalis dan sel tubuli proksimalis. Kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok perlakuan VB terlihat juga, lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok K+ dan MG tapi sedikit lebih rendah dibandingkan pada kelompok VA.
b) Pengamatan kuantitatif
Pengamatan secara kuantitatif terhadap enzim Cu,Zn-SOD dapat dilihat dari hasil perhitungan dan analisa statistik terhadap rata-rata jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi terhadap berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD. Hasil penghitungan jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD tersaji pada Tabel 2.
Tabel 2. Rata-rata jumlah sel tubuli renalis pada berbagai tingkatan kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal tikus perlakuan perlapang pandang pada pembesaran 20x
Jumlah inti sel tubuli renalis
Kelompok +++ ++ + - K- 54.13 ± 12.67c 56.07 ± 14.46d 21.00 ± 4.68b 18.80 ± 6.12a K+ 12.67 ± 7.72a 25.20 ± 12.78b 22.47 ± 5.53b 97.60 ± 6.78b VA 42.13 ± 6.50b 35.73 ± 11.06c 16.47 ± 3.68a 21.73 ± 5.05a VB 37.20 ± 11.97b 28.87 ± 7.06bc 21.13 ± 3.36b 31.67 ±12.85a MG 15.87 ± 6.49a 12.40 ± 7.05a 33.67 ± 6.23c 89.33 ±34.88b
Keterangan : (+++) = positif kuat; (++) = positif sedang; (+) = positif lemah; (-) = negatif. Superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan berbeda nyata pada (p<0.05).
Hasil uji statistik terhadap jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok K- paling tinggi dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya. Hal ini dapat dilihat dari jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat (+++) dan positif sedang (++) paling tinggi secara nyata (p<0.05).
Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok K+ lebih rendah dibandingkan dengan kelompok perlakuan K-, VA dan VB. Hal ini dapat dilihat dari jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat (+++) lebih rendah secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok K-, VA dan VB. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD ini juga terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi negatif (-) lebih tinggi secara nyata (p<0.05) pada kelompok K+ dibandingkan dengan kelompok K-, VA dan VB.
Pada kelompok VA dan VB kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok K+. Hal ini terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat (+++) pada kelompok VA dan VB lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok K+. Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD ini juga terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi negatif (-) lebih sedikit secara nyata (p<0.05) pada kelompok VA dibandingkan dengan kelompok K+.
Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok MG lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok VA dan VB. Hal ini terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi positif kuat (+++) pada kelompok MG lebih redah secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok VA dan VB. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD ini juga terlihat pada jumlah inti sel yang bereaksi negatif (-) pada kelompok MG lebih tinggi secara nyata (p<0.05) dibandingkan dengan kelompok VA dan VB.
c) Penghitungan persentase
Profil kandungan Cu,Zn-SOD juga terlihat dari hasil perhitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis tikus perlakuan yang bereaksi positif dan negatif terhadap Cu,Zn-SOD (Gambar 3).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 K- K+ VA VB MG KELOMPOK % J U M L A H (+) (-) Gambar 3. Persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang bereaksi positif (+) dan negatif
(-) terhadap Cu,Zn-SOD.
Hasil perhitungan persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif dan negatif terhadap kandungan antioksidan SOD dapat terlihat kandungan Cu,Zn-SOD pada kelompok K- paling tinggi dibandingkan kelompok perlakuan lain. Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD ini dapat terlihat dari persentase jumlah inti sel
yang bereaksi positif lebih tinggi (87.5%) dibanding perlakuan lain. Tingginya kandungan Cu,Zn-SOD ini juga dapat terlihat dari jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah (12.53%) dibanding perlakuan lain.
Kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok perlakuan K+ dan MG lebih rendah dibandingkan dengan dengan kelompok K-, VA dan VB. Rendahnya kandungan Cu,Zn-SOD ini dapat terlihat dari persentase jumlah jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih tinggi pada kelompok K+ dan MG (61,8% dan 59.1%) dibanding dengan kelompok K-, VA, dan VB yaitu sebesar 12.5%, 18.72%, dan 26.64%. Rendahnya antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok K+ dan MG juga dapat terlihat dari persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif lebih rendah pada kelompok K+ dan MG yaitu sebesar 38.2% dan 40.95% dibanding dengan kelompok K-, VA, dan VB yaitu sebesar 87.5%, 81,28%, dan 73.36%.
Kandungan antioksidan Cu,Zn_SOD pada kelompok VA lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok VB. Hal ini dapat dilihat dari persentase jumlah inti sel yang bereaksi positif lebih tinggi pada kelompok VA yaitu sebesar 81.28% dibanding kelompok VB yaitu 73.36%. Tingginya antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok VA juga dapat terlihat dari persentase jumlah inti sel yang bereaksi negatif lebih rendah pada kelompok VA yaitu sebesar 18.72% dibanding kelompok VB yaitu 26.64%.
PEMBAHASAN
Pada kondisi diabetes mellitus tubuh tidak mampu memetabolisme glukosa karena terjadi gangguan sekresi insulin yang dapat disebabkan oleh 3 hal, yaitu jumlah sekresi hormon insulin berkurang, resistensi insulin, atau kombinasi keduanya (Mc.Clung et al. 2004). Proses tubuh untuk mencari alternatif lain sebagai suplai energi seperti glikogenolisis dan glukoneogenesis akan menghasilkan produk sampingan yaitu radikal bebas (Maritim et al. 2003).
Cu,Zn-SOD merupakan salah satu antioksidan endogen yang amat berperan dalam mengkatalisasi radikal bebas anion superoxide menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen (Mates et al. 1999). Enzim Cu,Zn-SOD juga terdapat pada beberapa jaringan yang mempunyai fungsi sebagai bagian dari mekanisme pertahanan tubuh terhadap pengaruh buruk beberapa metabolisme oksigen (Fridovich 1975). Dari penelitian ini tinggi dan rendahnya antioksidan intraselular Cu,Zn-SOD dapat terlihat jelas pada tiap kelompok perlakuan.
Jumlah sel-sel tubuli renalis kelompok perlakuan K- yang mengalami degenerasi hingga nekrosa paling sedikit dan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD paling tinggi dibandingkan kelompok perlakuan lainnya. Hal tersebut dikarenakan kelompok perlakuan K- tidak diinduksi aloksan sehingga tidak timbul kondisi diabetes.
Sel-sel tubuli renalistikus pada kelompok K+ yang diinduksi aloksan dan hanya dicekok aquadest dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) terlihat mengalami beberapa perubahan patologis. Perubahan yang terjadi berupa degenerasi sel hingga nekrosa dan disertai peradangan menyebar pada sel tubuli renalis, sedangkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada kelompok ini paling rendah dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang lain.
Pada kondisi diabetes, tubuh akan mencari alternatif lain sebagai suplai energi. Proses alternatif tersebut akan menghasilkan produk sampingan yaitu radikal bebas. Bila proses ini berlangsung terus menerus radikal bebas yang terbentuk akan semakin banyak dan akan menyerang makromolekul. Makromolekul pembentuk sel akan mengalami kerusakan dan secara perlahan akan menyebabkan kematian pada sel. Antioksidan dibutuhkan untuk mengatasi
kondisi tersebut, sebagai akibatnya pada kondisi diabetes tubuh mengalami penurunan antioksidan intraselular (Larsson dan Ahren 1999). Penurunan antioksidan Cu,Zn-SOD terlihat pada kelompok positif diabetes pada penelitian ini.
Tingginya radikal bebas pada kondisi diabetes mellitus akan menyerang biomakromolekul yang merupakan komponen dinding sel dan secara perlahan mengakibatkan penurunan fungsi sel. Sel akan mengalami kerusakan berupa degenerasi hingga terjadi nekrosa. Banyaknya sel yang mengalami degenerasi hingga nekrosa pada kondisi diabetes mellitus dapat terlihat pada kelompok kontrol positif pada penelitian ini.
Kelompok MG yang mendapat perlakuan cekok minyak goreng dan induksi aloksan secara histopatologi terlihat mengalami degenerasi hingga nekrosa yang menyebar pada sel-sel tubuli renalis. Hasil pewarnaan imunohistokimia juga menunjukan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD yang lebih