3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat deskriptif. Penelitian ini tidak memberikan perlakuan terhadap variabel, namun hanya melihat ekspresi imunohistokimia p38 MAPK pengukuran variabelnya dilakukan hanya satu kali dan pada satu saat.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di RSUP. H. Adam Malik Medan dan Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU. Penelitian dilakukan mulai bulan Desember 2011-Mei 2012.
3.3 Populasi, Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel
3.3.1 Populasi
Populasi adalah penderita yang didiagnosis KNF berdasarkan anamnesis, pemeriksaan fisik, pemeriksaan radiologi dan hasil biopsi histopatologi yang berobat ke Divisi Onkologi-Bedah Kepala Leher Departemen THT-KL FK USU/RSUP H. Adam Malik Medan
Kriteria Populasi
1. Penderita yang didiagnosis KNF, baik laki-laki maupun perempuan.
2. Penderita yang belum pernah mendapat pengobatan dengan radioterapi, kemoterapi atau kombinasi keduanya.
3. Bersedia diikutsertakan dengan menandatangani informed consent
3.3.2 Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah total populasi penelitian.
3.3.3 Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel penelitian adalah dengan secara non probability consecutive sampling
3.4 Variabel Penelitian
Variabel pada penelitian ini adalah : 1. Karsinoma nasofaring
2. Umur
3. Jenis kelamin 4. Tipe histopatologi 5. Ukuran tumor primer (T)
6. Ukuran pembesaran kelenjar getah bening (N) 7. Stadium klinis
3.5 Defenisi Operasional
1. Karsinoma nasofaring adalah tumor ganas berasal dari sel epitel yang melapisi permukaan nasofaring yang ditegakkan berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologi dan dinilai berdasarkan kriteria WHO.
2. Jenis kelamin sesuai dengan yang tercatat pada rekam medis yaitu: a. Laki-laki
b. Perempuan
3. Umur adalah usia yang dihitung dalam tahun dan perhitungannya berdasarkan kalender masehi. Umur penderita karsinoma nasofaring sesuai dengan yang tercatat pada rekam medis, dikelompokkan atas:
a. ≤20 tahun b. 21-40 tahun c. 41-60 tahun d. >60 tahun
4. Tipe histopatologi karsinoma nasofaring adalah jenis dari suatu tumor ganas yang sediaannya diambil dari jaringan nasofaring dan dilihat dibawah mikroskop oleh ahli patologi anatomi yang hasil pemeriksaannya dikelompokkan berdasarkan kriteria WHO:
Tipe 1 : Keratinizing Squamous cell carcinoma Tipe 2: Non keratinizing squamous cell carcinoma
5. Tumor primer (T) karsinoma nasofaring adalah besar dan perluasan tumor primer sesuai kriteria AJCC tahun 2010 yang diukur oleh ahli Radiologi dengan memakai CT-Scan.
Hasil ukur : 1, 2, 3, 4
T1: Tumor terbatas di nasofaring atau tumor meluas ke orofaring dan/kavum nasi tanpa perluasan ke parafaring.
T2: Tumor dengan perluasan ke daerah parafaring.
T3: Tumor melibatkan struktur tulang dasar tengkorak dan/atau sinus paranasal
T4: Tumor dengan perluasan intrakranial dan/atau terlibatnya syaraf kranial, hipofaring, orbita atau dengan perluasan ke fossa infratemporal/ruang mastikator.
6. Ukuran kelenjar getah bening leher (N) adalah ukuran kelenjar getah bening leher sesuai kriteria AJCC tahun 2010 yang diukur oleh ahli Radiologi dengan memakai CT-Scan.
Hasil ukur : 0,1,2,3
N0: Tidak ada metastase ke KGB regional
N1: Metastase kelenjar getah bening leher unilateral dengan diameter terbesar 6 cm atau kurang, di atas fossa supraklavikular, dan/atau unilateral atau bilateral kelenjar getah bening retrofaring dengan diameter terbesar 6 cm atau kurang.
N2: Metastase kelenjar getah bening bilateral dengan diameter terbesar 6 cm atau kurang, di atas fossa supraklavikular.
N3: Metastase pada kelenjar getah bening diatas 6 cm dan/atau pada fossa supraklavicular.
7. Stadium karsinoma nasofaring adalah penentuan stadium penyakit berdasarkan klasifikasi AJCC tahun 2010 yang dikelompokkan: I, II, III, IV 8. Ekspresi p38 MAPK adalah Pada pewarnaan immunohistokimia p38 MAPK
ditemukan pewarnaan coklat pada sitoplasma dan inti sel. Untuk skor akhir digunakan skor imunoreaktif. Skor imunoreaktif diperoleh dengan mengalikan skor luas dengan skor intensitas. Kontrol positif yang digunakan berasal dari jaringan plasenta yang dilakukan pewarnaan immunohistokimia. Kontrol negatif yang digunakan berasal dari jaringan karsinoma nasofaring yang dilakukan pewarnaan immunohistokimia tanpa memberikan antibody p38 MAPK.
Ekspresi p38 MAPK negatif : 0 – 3 Ekspresi p38 MAPK positif / overekspresi : 4 – 9
3.6 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah jaringan nasofaring dalam bentuk blok parafin yang didiagnosis sebagai karsinoma nasofaring. Bahan ini diperiksa secara immunohistokimia dengan menilai immunoreaktivitas antibodi MAPK.
0 : berarti negatif Skor luas dinilai :
2 : pewarnaan positif 10-50% jumlah sel 3 : pewarnaan positif > 50% jumlah sel
0 : berarti negatif
Skor intensitas dihitung :
1 : lemah 2 : moderat 3 : kuat
Untuk skor akhir digunakan skor imunoreaktif. Skor imunoreaktif diperoleh dengan mengalikan skor luas dengan skor intensitas. Skor imunoreaktif 4 atau lebih dinilai positif atau overekspresi p38 MAPK.
Hasil ukur : 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9
3.7 Instrumen Penelitian
Penelitian ini membutuhkan beberapa peralatan dan reagen sebagai berikut: a. Catatan medis penderita dan status penelitian penderita
b. Formulir persetujuan ikut penelitian
c. Reagen untuk pemeriksaan hispatologi: formalin 10%, blok paraffin, aqua destillata, hematoxyllin-eosin.
d. Reagen untuk pemeriksaan immunohistokimia: xylol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, H202 0,5% dalam methanol, Tris Buffer Saline (TBS), antibody MAPK, Envision, Choromogen Diamino Benzidine (DAB). Lathium Carbonat jenuh, Tris EBTA, Hematoxylin, aqua destillata.
e. Alat untuk biopsy: blakesley nasal foscep lurus/bengkok, endoskopi kaku, 4 mm, 00.
f. Alat untuk pemeriksaan immunohistokimia: Sistem visualisasi immunohistokimia (Envision kit), mesin pemotong jaringan (microtome), silanized slide.
3.8 Prosedur Kerja Pemeriksaan Immunohistokimia p38 MAPK:
1. Deparafinisasi slide (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3) @ 5 menit 2. Rehidrasi (Alkohol absolute, Alk 96%, Alk 80%, Alk 70%) @ 4 menit
3. Cuci dengan air mengalir 5 menit
4. Masukkan slide ke dalam PT Link Dako Epitope Retrieval : set up Preheat 65°C, Running time 98°C selama 15 menit.
± 1 jam
5. Pap Pen. Segera masukkan dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
6. Blocking dengan peroxidase block 5-10 menit
7. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 5 menit 8. Blocking dengan Normal horse Serum (NHS) 3 % 15 menit 9. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 5 menit 10. Inkubasi dengan Antibodi p38 MAPK dengan pengenceran 1:40 1 jam 11. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 /Tween 20 5 menit
12. Dako Real Envision Rabbit/Mouse 30 menit
13. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 /Tween 20 5-10 menit 14. DAB+Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20 µL
DAB : 1000 µL substrat (tahan 5 hari di suhu 2-8°C setelah di-mix)
5 menit
15. Cuci dengan air mengalir 10 menit
16. Counterstain dengan Hematoxylin 3 menit
17. Cuci dengan air mengalir 5 menit
19. Cuci dengan air mengalir 5 menit
20. Dehidrasi (Alk 80%, Alk 96%, Alk Abs) @5 menit
21. Clearing (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3) @5 menit
22. Mounting + cover glass
3.9 Cara Pengumpulan Data
Data diambil dari hasil pemeriksaan di Departemen THT-KL FK USU/RSUP H. Adam Malik Medan dan pemeriksaan histopatologi dan imunohistokimia di Departemen Patologi Anatomi FK USU.
3.10 Cara Analisis Data
Data yang telah terkumpul dideskripsikan untuk menjelaskan distribusi frekuensi umur, jenis kelamin dan tipe histopatologi pada KNF. Untuk menilai kebermaknaan antara variabel yang diteliti, maka dilakukan uji Chi-square dan
3.11 Kerangka Kerja PEMERIKSAAN IMMUNOHISTOKIMIA MAPK KARSINOMA NASOFARING NEGATIF : Skor 0-3 Positif/overekspresi: Skor 4-9 Ukuran tumor primer Ukuran pembesaran KGB leher Histopatologi jaringan Stadium Klinis Ukuran tumor primer Ukuran pembesaran KGB leher Histopatologi jaringan Stadium Klinis
BAB 4
