3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan jarak kepyar yang diperoleh dari Desa Cingkes, Kabupaten Simalungun, Sumatera Utara (lampiran 1). Identifikasi sampel dilakukan di Laboratorium Herbarium Medanese (MEDA) Universitas Sumatera Utara (lampiran 2). Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei 2019 sampai November 2019 di laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati FMIPA USU dan Laboratorium Pascasarjana Kimia FMIPA USU. Identifikasi senyawa meliputi analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dengan menggunakan pelarut metanol dilakukan di Laboratorium ITB pada tanggal 29 Oktober 2019, Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium Kimia Organik FMIPA UGM pada tanggal 29 Oktober 2019.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Penelitian
Spektrofotometer 1H-NMR (Agilent 2NMR 500MHz), Spektrofotometer FT-IR (Shimadzu), Spektrofotometer UV-Vis (Hewlett Packard agilent), Kolom Kromatografi (pyrex), Rotarievaporator (Heidolph), Lampu UV (254nm/356nm), UVGL5 8, Neraca Analitis (Mettler AE 200), Chamber, Ekstraktor, Alat Destilasi, Corong pisah (Pyrex), Beaker glass, Erlenmeyer, Penangas Air, Gelas ukur, Botol vial, Pipa Kapiler, Statif dan klem.
3.2.2 Bahan Penelitian
Serbuk daun jarak kepyar, Metanol (Teknis), Etil asetat (Teknis), n-heksan (Teknis), Silika Gel (70 – 230 mesh, E-merck kgA), FeCl3 5%, Serbuk Mg, HCl(p) ,
H2SO4(p), kapas, kloroform (p.a E.Merck), Plat KLT silika gel 60 F254 (E.Merck Art 554), Plat KLT Preparatif 60 F254, Aseton (p.a Merck).
3.3 Penyediaan Sampel
Daun jarak kepyar dikeringkan diudara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun jarak kepyar sebanyak 2000 g.
3.4 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Jarak Kepyar
Serbuk kering halus daun jarak kepyar diidentifikasi dengan melakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna dengan cara memasukkan 10 gram serbuk daun jarak kepyar yang telah dikeringkan kedalam gelas Erlenmeyer, kemudian ditambahkan 100 mL etil asetat lalu didiamkan setelah itu disaring.
Ekstrak sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan pereaksi FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam.
3.5 Ekstraksi Daun Jarak Kepyar
Serbuk daun jarak kepyar ditimbang sebanyak 2000 gram, kemudian dimaserasi menggunakan metanol sebanyak 10 liter hingga semua sampel sampai terendam dan dibiarkan ± 2 hari. Maserat ditampung dan dipekatkan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan pada penangas air hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan ekstrak metanol dengan etil asetat kemudian disaring. Filtrat etil asetat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Fraksi etil asetat dilarutkan kembali dengan metanol dan diekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksan sampai lapisan n-heksan hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol.
3.6 Analisa Kromatografi Lapis Tipis
Analisa kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fase diam silika gel 60F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10; 80:20; 70:30 (v/v).
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak kloroform : metanol (90:10) v/v kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang
telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Dilakukan perlakuan yang sama untuk perbandingan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 80:20; 70:30 (v/v).
3.7 Pemisahan Senyawa Fenolik dengan Kromatografi Kolom
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 (70-230 mesh) dengan menggunakan kloroform, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 6,0 gram ekstrak pekat metanol dengan silika gel dengan pelarut metanol, kemudian dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : metanol (90:10) v/v secara perlahan-lahan. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fase gerak kloroform : metanol dengan perbandingan 80:20; 70:30 v/v. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl3 5%. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta. Pasta yang diperoleh dianalisis kromatografi lapis tipis dengan eluen kloroform : etil asetat (90:10) v/v.
Kemudian di KLT preparatif dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform : etil asetat (90:10) (v/v), dikeringkan dan disinari dibawah lampu UV. Digerus dari plat dan dielusi dengan campuran metanol : etil asetat 1:1 dan diuapkan.
3.8 Pemurnian Senyawa Hasil Isolasi
Pasta yang diperoleh dari pemisahan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan metanol lalu dianalisis KLT untuk KLT preparatif. Kloroform : etil asetat 70:30 (v/v) adalah fase gerak yang menunjukkan pemisahan yang paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Pasta yang telah dilarutkan ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT. Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusi dengan metanol : etil asetat (1:1) v/v. Filtrat yang diperoleh
dianalisis dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F254 dengan fase gerak kloroform : etil asetat 70:30 (v/v).
3.9 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
Senyawa hasil isolasi dianalisis dengan tiga jenis spektrofotometer yaitu spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR), dan Spektrofotometer Resonansi Magnet Inti Proton (1H-NMR).
3.9.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer Ultraviolet Visible (UV-Vis)
Identifikasi dilakukan dengan alat Spektrofotometer Ultraviolet Visible menggunakan pelarut metanol, dengan :
Spesifikasi Alat : - Merek Shimadzu - UV 1800
Waktu Pengerjaan : 29 Oktober 2019 Teknisi Penanggung Jawab : Roch Fitni
3.9.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Identifikasi dilakukan dengan alat Spektrofotometer Infra Merah menggunakan pelet KBR, dengan:
Spesifikasi Alat : - Merek Shimadzu - Prastige 21 Waktu Pengerjaan : 29 Oktober 2019 Teknisi Penanggung Jawab : Roch Fitni
3.9.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Identifikasi dilakukan dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton menggunakan pelarut metanol, dengan :
Spesifikasi Alat : - Sistem konsol DD2 - Frekuensi 500 MHz (1H) Waktu Pengerjaan : 29 Oktober 2019
Teknisi Penanggung Jawab : Elvira Hermawati
3.10 Bagan Penelitian 3.10.1 Uji Skrining Fitokimia
3.10.2 Pemisahan Senyawa Fenolik Dari Daun Tumbuhan Jarak Kepyar
BAB 4