3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2016 sampai dengan Januari 2018 di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Genetika Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara.
3.2 Metode Penelitian
3.2.1 Preparasi Medium Luria Bertani (LB)
Medium pertumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium Luria Bertani (LB). Medium LB (per liter mengandung 10 g tripton, 5 g yeast extract, 10 g NaCl). Bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diaduk rata, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan setelah itu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.2.2 Pengambilan Sampel Tanah
Sampel tanah diperoleh dari hutan Tongkoh. Sebelum sampel dikoleksi, terlebih dahulu diukur kondisi tanah yang meliputi pengukuran GPS, pH tanah, dan kelembapan tanah. Pengambilan lokasi sampel pada 3 titik dilakukan secara acak dan sampel tanah yang diambil merupakan bagian permukaan tanah 5-10 cm.
Sampel tanah yang diambil sebanyak 100 gram secara aseptis menggunakan sekop, dimasukkan ke dalam kantong plastik steril, dan disimpan pada suhu 40C.
Sampel tanah dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi MIPA Universitas Sumatera Utara untuk diidentifikasi (Lantang dkk. 2012; Chandra dkk. 2015).
3.2.3 Isolasi dan Pemurnian Bakteri B. thuringiensis
Teknik isolasi menggunakan metode yang dijelaskan oleh Travers dkk.
(1987), yang dimodifikasi (Lampiran 3). Sampel Tanah ditimbang sebanyak 25
gram. Sampel tanah dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang telah berisi 250 ml buffer asetat 0,25 M pH 6,8 (Lampiran 2), dan dikocok kuat selama 15 menit, kemudian dipanaskan pada suhu 800 C selama 30 menit dalam waterbath, lalu di kocok kuat untuk meratakan penyebaran spora selama 15 menit (Ozturk dkk., 2008). Suspensi kemudian diencerkan menggunakan pengenceran berseri, sebanyak 1 ml supensi dimasukkan ke dalam tabung berisi 9 ml 0,25 M buffer asetat pH 6,8 (pengenceran 102) lalu dihomogenkan menggunakan vortex.
Suspensi sebanyak 1 ml pada pengenceran 102 di masukkan ke dalam tabung berisi buffer asetat 0,25 M pH 6,8 (pengenceran 103) dan seterusnya sampai pengenceran 108. Sebanyak 0,1 ml suspensi disebarkan pada cawan petri yang berisi mediun LB dan di inkubasi pada suhu 300C selama 48 jam, hingga muncul koloni yang memiliki kesamaaan morfologi dan warna yang sama dengan B.
thuringiensis (Moazamian dkk. 2016). Hasil isolasi yang diperoleh, dipilih koloni yang mirip dengan B. thuringiensis, lalu di transfer ke medium LB agar dan di inkubasi pada suhu 300C selama 4-5 hari sampai terjadi sporulasi (Senfi dkk., 2012).
3.2.4 Karakterisasi Morfologi Isolat
Morfologi isolat bakteri diamati pada kultur isolat. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk, elevasi, tepian, dan warna koloni, sifat gram, kristal protein, dan dilakukan uji biokimia.
3.2.5 Pewarnaan Kristal Protein
Setiap kultur murni ditumbuhkan pada medium LB agar selama 48-72 jam pada suhu 300C. Kultur biakan diambil 1-2 lup ose steril ke permukaan slide dan diberi 1-2 tetes akuades. Slide kemudian difiksasi dan diberi 1-2 tetes Coomassie Brilliant Blue Solution (0,25% Coomassie Brilliant Blue, 50% etanol dan 7%
asam asetat) selama 3 menit. Slide kemudian dicuci dengan air, lalu dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop cahaya untuk mengamati morfologi kristal (Senfi dkk., 2012). Isolat yang didefinisikan sebagai B. thuringiensis yang membentuk
kristal protein disimpan pada LB agar miring sebagai isolat baru dan diberi nomor isolat (Lampiran 4).
3.2.6 Pengamatan Kristal Protein Menggunakan SEM (Scanning Electron Microscopy)
Pengamatan SEM dilakukan di Laboratorium Zoologi LIPI (Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia) Cibinong. Isolat bakteri diinokulasikan pada medium LB dan diinkubasi pada incubator shaker pada 150 rpm dengan suhu 300C selama 72 jam. Proses preparasi spesimen dalam suhu 40C. Isolat di sentrifugasi pada 10.000xg selama 10 menit, supernatan dibuang dan ditambahkan caccodylate buffer 2%, (Lampiran 2) kemudian direndam beberapa jam. Cairan disentrifugasi kembali, larutan fiksatif dibuang, kemudian ditambahkan caccodylate buffer 2%.
Cairan disentifugasi kembali, larutan buffer dibuang dan ditambahkan tetra oksida 1%, kemudian direndam selama 1 jam. Cairan disentrifugasi kembali, kemudian larutan dibuang dan ditambahkan alkohol 50%, selanjutnya berturut-turut ditambahkan alkohol 70%; alkohol 80%; alkohol 95%; dan alkohol absolut.
Sentrifugasi kembali, kemudian larutan dibuang, ditambahkan butanol dan dibuat suspensi di dalam butanol. Potongan cover slip dibekukan dan dibuat ulasan suspensi pada cover slip, lalu dikeringkan dengan freeze drier. Objek pada cover slip dilapisi emas menggunakan vaccum drier. Objek diamati dengan mikroskop skaning elektron JSM-5310 pada 20 KV (Ahmed dkk., 2015).
3.2.7 Identifikasi Bacillus thuringiensis Berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Isolasi DNA dilakukan dengan metode Muharsini dkk. (2003), isolat bakteri murni ditumbuhkan pada media LB agar. Sebanyak satu ose isolat disuspensikan ke dalam tabung ependorf yang berisi 100 µl akuabidest steril. Suspensi sel dibekukan pada suhu -100C sampai larutan mengkristal lalu dipanaskan pada suhu 900C selama 10 menit. Pengulangan siklus dilakukan sebanyak 5 kali untuk efisiensi pemecahan sel (Nursyiwarni dan Kathy, 2007).
Suspensi sel diputar dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000xg selama 10 menit. Supernatan (yang telah mengandung DNA bakteri) disimpan pada suhu 40C. DNA hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA dengan menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan untuk untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah primer 63f (5’ – CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC - 3’) dan 1387r (5’ – GGG CGG WGT GTA CAA GGC - 3’) yang merupakan primer universal untuk berbagai strain bakteri (Salaki dan Sembiring 2011; Marchesi dkk. 1998).
Sebanyak 2 µl DNA template; 12,5 Master Mix 2x GoTaqGreen; 1 µl (10 pmol) masing-masing primer; 8,5 µl Nuclease Free Water sehingga volume total 25 µl. PCR dilakukan pada volume total 25 µl dengan menambahkan 12,3 µl akuabides. Mesin PCR diprogram dan dijalankan pada kondisi pradenaturasi 940C selama 2 menit, denaturasi 920C selama 30 detik, annealing 550C selama 30 detik, elongasi atau perpanjangan primer 720C selama 1 menit dan post PCR 720C selama 5 menit dan dilakukan sebanyak 40 siklus selama satu jam.
Hasil PCR divisualisasi pada gel agarosa 1% (1 gr agarosa dalam 100 ml TAE 1X), dipanaskan serta distirer sampai larut, didinginkan selama 5 menit lalu diteteskan 10 µl EtBr dan dihomogenkan lalu dituang ke dalam cetakan gel. Pada waktu elektroforesis diberikan marker atau penanda molekul DNA 1 kb.
Elektroforesis dilakukan pada kondisi 80 volt dan 400 mA selama 60 menit, kemudian divisualisasi dengan UV-transluminator.
DNA hasil amplifikasi tersebut dimurnikan lalu disekuen secara komersial untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Data sekuen tersebut dibandingkan dengan data di GenBank dari database The National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
3.2.8 Pengaruh Medium Molase-Urea Terhadap Pertumbuhan Bacillus thuringiensis
Isolat diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml NaCl 0,9%
steril dan dihitung optical density dengan menggunakan spektrofotometer. Kultur
isolat dengan OD600 ≈ 0,5 diambil sebanyak 2,5 ml dan dimasukkan ke dalam media pertumbuhan, molase sebagai sumber karbon dan urea sebagai sumber nitrogen. Medium MU (molase-urea) perliter mengandung molase sebanyak 20%
(w/v), urea sebanyak 3% (w/v) (Nasrah 2012; Fifendy dkk. 2013) dan komposisi garam-garam mineral berdasarkan Dulmage dan Rhodes (1971), yaitu 1,0 g/l CaCO3; 0,03 g/l MgSO4.7H2O; 0,02 g/l MnSO4.7H2O; 0,02 g/l ZnSO4.7H2O; dan 0,02 g/l FeSO4.7H2O, masing-masing dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Media molase-urea disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C, kemudian di inkubasi dalam rotary shaker selama 72 jam pada 150 rpm. Setiap kultur pada interval 6 jam diambil.
Sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 9 ml akuades steril, kemudian di vortex sampai homogen dan kemudian dilakukan pengenceran berseri 101-1010. Masing-masing pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml dan ditambahkan ke dalam media PCA (Plate Count Agar) dengan menggunakan metode cawan sebar dan diikubasi selama 24 jam. Pengamatan bakteri di lakukan dengan menentukan nilai ALT (Angka Lempeng Total) pada PCA (Lampiran 7).
3.2.9 Uji Toksisitas Terhadap Larva Aedes aegypti
Isolat bakteri ditumbuhkan pada medium LB agar dan diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam. Isolat diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml air akuades steril dan dihitung optical density dengan menggunakan spektrofotometer. Kultur isolat dengan OD600 ≈ 0,5 diambil sebanyak 2,5 ml dan diinokulasikan ke dalam 47,5 ml medium MU (molase-urea) dan diinkubasi pada suhu 300C selama 36 jam. Kultur isolat pada media MU diambil sebanyak 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, dan 25 ml dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 10 ekor larva nyamuk A. aegypti instar III. Toksisitas ditentukan berdasarkan persentase kematian larva 50 % setelah 24 jam. Pengamatan dilakukan sebanyak empat kali ulangan dengan enam konsentrasi perlakuan dan nilai mortalitas dihitung (Lampiran 8).
BAB IV