Tempat dan Waktu Penelitian
Survei dan pengambilan sampel dilakukan di tambak udang tradisional dan intensif yang berlokasi di pantai utara Jawa Barat. Pengujian V.
parahaemolyticus patogenik pada sampel udang tambak dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bioteknologi Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Badan Riset Kelautan dan Perikanan, Kementerian Kelautan dan Perikanan, Slipi, Jakarta Pusat. Penelitian ini dilakukan sejak bulan Agustus 2010 hingga Maret 2011.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang vaname (Litopenaeus vannamei) yang berasal dari tambak tradisional dan insentif. Sebagai kontrol positif digunakan isolat V. parahaemolyticus penghasil TDH dan TRH yang merupakan koleksi Fakultas Farmasi Universitas Andalas-Padang yang berasal dari Kyoto University. Media untuk isolasi dan konfirmasi V. parahaemolyticus presumtif adalah media cair tryptic soy broth (TSB), alkaline saline pepton water (ASPW), media agar thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS), tryptic soy agar (TSA), motility test medium (MTM), triple sugar iron (TSI), dan media untuk pewarnaan gram. Seluruh media, kecuali untuk pewarnaan gram dan TCBS ditambahkan NaCl sampai 3%. Media untuk konfirmasi V. parahaemolyticus menggunakan API 20E biochemical test kit. Bahan- bahan untuk isolasi DNA antara lain media cair tryptic soy broth (TSB) +2.5%NaCl, TE buffer, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS), Cetyiltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB), Natrium Chloride (NaCl), proteinase-K, sodium asetat, RNase, fenol, kloroform, isoamil alkohol, isopropanol, etanol 70%. Bahan- bahan untuk elektroforesis DNA meliputi bufer TBE, agarosa, dan sybr safe gold. Bahan-bahan yang digunakan untuk amplifikasi gen tdh dan trh antara lain Go Taq Green Master Mix (Promega) yang terdiri dari Go Taq DNA polymerase, bufer
PCR, 3mM MgCl2, dan dNTP (masing-masing 0.4 mM dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), DNA/RNA free water, cetakan DNA, standard DNA ladder 100bp, dan primer oligonukleotida untuk gen tdh dan trh yang masing-masing memiliki ukuran amplikon 251 bp dan 250bp (Tada et al. 1992). Urutan basa primer untuk gen tdh dan trh dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Primer oligonukleotida yang digunakan untuk deteksi gen tdh dan trh
Target DNA Ukuran
amplikon Urutan basa (5’-3’)
GGT ACT AAA TGG CTG ACA TC (forward)
Gen tdh 251bp
CCA CTA CCA CTC TCA TAT GC (reverse) GGC TCA AAA TGG TTA AGC G (forward)
Gen trh 250bp
CAT TTC CGC TCT CAT ATG C (reverse)
Tada et al. (1992)
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peti berinsulasi, termometer, botol plastik steril, plastik steril, mikroeppendorf 1.5 ml, 200µl, erlenmeyer 250 ml, 125 ml, timbangan digital, stomacher, vorteks, tabung reaksi bertutup, jarum ose, cawan petri, botol pengencer, refrigerator, refrigerator -20oC, sentrifius, inkubator 37°C, autoklaf, laminar air flow, mikropipet beserta tip ukuran 10, 100, 200, dan 1000µl, DNA/RNA/protein analyser, PCR system thermal cycler (Gene AMP PCR 9700), perangkat elektroforesa (Model B1A; owl separation system), gel documentation (EC 250-90; EC apparatus coorporation), dan UV transillumination (UVT 20 M; Herolab, BDA Digital Biometra). Perangkat lunak (software) yang digunakan adalah apiwebTM (Biomeireux) untuk menganalisis hasil uji biokimia dengan API 20E biochemical test kit.
Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam beberapa tahapan yang meliputi (1) survei lapang lokasi tambak tradisional dan intensif, (2) pengambilan sampel udang dari tambak tradisional dan intensif hasil survei, (3) isolasi V. parahaemolyticus dari sampel udang, (4) karakterisasi sifat fenotipik berdasarkan identifikasi isolat secara biokimiawi, (5) identifikasi V. Parahaemolyticus patogenik dari isolat V.
parahaemolyticus berdasarkan amplifikasi gen penyandi tdh dan trh. Tahapan kegiatan penelitian dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Diagram alir pelaksanaan penelitian
Survei Lapang
Survei lapang dilakukan untuk untuk menentukan lokasi tambak udang yang berpotensi mengandung V. parahaemolyticus baik di tambak tradisional dan intensif. Pengumpulan data dan informasi pada survei lapang meliputi :
a. Pengumpulan informasi lokasi dan jumlah tambak udang (tradisional dan intensif) yang masih beroperasi.
b. Pengumpulan informasi waktu panen tambak udang sebagai penentuan pengambilan sampel udang.
c. Pengumpulan informasi yang terkait dengan kondisi lingkungan tambak seperti salinitas, pH, suhu, luas areal tambak, waktu panen, dan data dukung lainnya .
Pengambilan dan Preparasi Sampel Udang Tambak
Pemilihan tambak udang yang akan diambil sampelnya pada setiap daerah dilakukan secara acak (random). Jenis tambak yang akan diambil sampelnya adalah tambak dengan sistim tradisional dan intensif hasil survei lapang. Kriteria tambak yang akan diambil sampelnya adalah tambak siap panen dengan berat udang per ekor di atas 20g dengan masa budidaya di atas 2.5 bulan. Jumlah tambak disesuaikan dengan jumlah tambak yang siap panen dan tata letaknya dimana antara tambak tradisional dan intensif yang akan diambil sampelnya berjumlah sama. Setiap tambak akan diambil sampel udang sebanyak 500g dari beberapa titik yang cukup mewakili keberadaan udang dalam tambak. Pengambilan sampel udang pada setiap tambak dilakukan 2 kali yang merupakan ulangan pengambilan sampel. Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis dengan plastik steril. Sampel lalu ditempatkan pada peti berinsulasi (cool box) yang berisi es curah dan dibawa ke laboratorium untuk dilakukan pengujian.
Isolasi Vibrio parahaemolyticus dari Udang Tambak
Isolasi V. parahaemolyticus dilakukan berdasarkan metode
Bacteriological Analytical Manual (BAM)-FDA (Kaysner dan DePaola, 2004). Tahap awal isolasi adalah tahap pengkayaan (enrichment) yaitu sebanyak 25g sampel udang (jika ukuran udang kecil, ambil seluruh bagian udang, jika ukuran udang besar ambil bagian daging termasuk insang dan usus) dimasukkan ke dalam 225ml ASPW kemudian dilakukan homogenisasi menggunakan stomacher pada kecepatan 260 rpm selama 1 menit. Selanjutnya homogenat diinkubasikan pada suhu 37±2°C selama 18-24 jam. Sebanyak 1 loopful homogenat dari media ASPW digoreskan ke media agar selektif TCBS dan diinkubasi pada suhu 37±2°C selama 24 jam. Koloni V. parahaemolyticus ditandai dengan ciri-ciri : koloni berbentuk bulat, diameter 2-3mm, koloni berwarna hijau atau hijau kebiruan pada bagian tengah serta tidak memfermentasi sukrosa. Sebanyak 2-3 koloni suspect digoreskan pada media agar miring TSA+2.5%NaCl dan diinkubasi pada suhu
37± 2°C selama 24 jam. Kultur yang tumbuh selanjutnya dijadikan sebagai inokula untuk pengujian biokimia pada tahap konfirmasi koloni tipikal.