Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Resort Mandalawangi TNGGP pada elevasi 1300-2500 mdpl dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB. Penelitian dilakukan selama ± 4 bulan.
Alat dan Bahan Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas:
1. Perlengkapan eksplorasi dan pengukuran komponen fisik lingkungan, seperti: kompas, GPS, termometer, hygrometer, clinometer, christenmeter, kamera, binokuler, pita meter, tali rapia dan tambang.
2. Sampel daun tabat barito, telur A. salina, pelarut, air laut, peralatan gelas (labu erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, gelas piala, gelas ukur, pipet volumetrik dll), perangkat ekstraksi, alat timbangan dan rotary evaporator.
Metode Pengambilan Data
Pengambilan Data mengenai Karakteristik Habitat Mikro Tabat Barito Pengambilan data dilakukan dengan cara eksplorasi stratifikasi (Bennett dan Emberson 2009) pada elevasi 1300-2500 mdpl. Pada setiap 100 mdpl dilakukan eksplorasi untuk mencari tabat barito yang merupakan tumbuhan epifit dari 20 individu tumbuhan inang, selanjutnya dilakukan pengukuran karakteristik habitat mikronya. Pengambilan sampel daun tabat barito dilakukan setelah
melakukan desk study untuk menentukan spesies tabat barito yang akan diambil sampel daunnya.
Karakteristik habitat mikro tabat barito yang diamati meliputi:
a) Pohon inang (nama jenis, tinggi pohon, tinggi bebas cabang, diameter batang, luas tajuk).
b) Ketinggian tabat barito dari permukaan tanah.
c) Jumlah individu tabat barito dalam setiap pohon inang.
d) Penyebaran tabat barito pada setiap pohon (pada bagian batang, cabang atau ranting).
e) Media tumbuh tabat barito pada tumbuhan inangnya. f) Suhu dan Kelembaban udara
Pengukuran suhu dan kelembaban dilakukan dengan menggunakan hygrometer. Alat diletakkan pada ketinggian tertentu dan diusahakan sedekat mungkin dengan tumbuhan tabat barito.
g) Fisiografi
Kemiringan/Besar Lereng
Kemiringan lahan atau besar lereng diukur dengan menggunakan clinometer.
Arah Lereng
Untuk mengetahui arah lereng digunakan alat penunjuk arah yaitu kompas. Ketinggian dari Permukaan Laut (elevasi)
h) Media tumbuh tabat barito sebagai epifit
Sampel media tumbuh tabat barito diambil dari bahan organik yang terdapat pada perakaran tabat barito.
Uji Sifat Kimia Media Tumbuh Tabat Barito
Analisis dilakukan di Balai Penelitian Tanah, Kementerian Pertanian. Analisis dilakukan terhadap sifat kimia media tumbuh tabat barito (pH, C-organik, N, P, K dan Ca).
Uji Kandungan Bioaktif Daun Tabat Barito
Analisis kandungan bioaktif daun tabat barito dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB, dengan tahapan sebagai berikut:
1)Pengumpulan dan Persiapan Contoh
Sampel daun tabat barito dikeringkan dan digiling sehingga didapatkan serbuk daun tabat barito.
2)Ekstraksi
Serbuk daun tabat barito dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan pelarut ke dalamnya menggunakan pelarut etanol 70% lalu diekstraksi dengan metode sonikasi dengan waktu ekstraksi selama 15 menit. Nisbah jumlah bahan dengan pelarut yang digunakan adalah 1 : 10. Residu kemudian ditambah lagi pelarut yang sama dan diekstraksi dengan kondisi operasi yang sama. Selanjutnya maserat disatukan dan dikeringkan dengan penguap putar (rotary evaporator). Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang dan ditentukan rendemennya.
3)Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Alkaloid. Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 ml CHCl3 dan 4
tetes NH4OH kemudian disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam tabung
H2SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain.
Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna yang berturut- turut putih, cokelat, dan merah jingga.
Saponin. Sebanyak 0.1 g ekstrak dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 10 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian dikocok selama 10 detik dan dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil.
Triterpenoid dan steroid. Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dengan 25 ml etanol panas (50oC) kemudian hasilnya disaring ke dalam pinggan porselin dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes kemudian ditambahkan 3 tetes anhidridaasetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (Uji Lieberman-Buchard). Warna merah atau ungu menunjukkan
kandungan triterpenoid sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid.
Tanin. Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebagian filtrat yang diperoleh ditambah larutan FeCl3 1%. Hasil positif ditunjukkan oleh terbentuknya warna hijau kehitaman.
Flavonoid. Sebanyak 0.1 g ekstrak dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 10 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 ml HCl pekat, dan 1 ml amil alkohol kemudian dikocok dengan kuat. Uji positif flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Uji Toksisitas Larva Udang (Brine Shrimp Lethality Test)
Ekstrak yang diperoleh dari ekstraksi dengan pelarut etanol 70% kemudian diuji toksisitasnya dengan menggunakan larva udang. Kegiatan diawali dengan penetasan telur A. salina. Telur ditetaskan di dalam gelas piala ukuran 1 liter yang diisi air laut dilengkapi dengan aerator dan lampu. Telur dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Telur yang telah menetas menjadi larva digunakan untuk uji toksisitas. Selanjutnya dilakukan penyiapan larutan ekstrak uji.
Pengujian dilakukan dengan 4 variasi konsentrasi, yaitu yaitu 10 ppm, 100 ppm, 500 ppm dan 1.000 ppm. Setiap konsentrasi dilakukan pengulangan sebanyak 3 (tiga) kali. Setiap ekstrak dari tiap pohon inang diuji dan ditambah 1 kontrol, sehingga ada 3 contoh uji dan 1 kontrol. Kontrol dikerjakan tanpa penambahan ekstrak. Untuk membuat berbagai konsentrasi ekstrak maka terlebih dahulu membuat larutan induk ekstrak 2.000 ppm. Tahapan-tahapan yang dilakukan yaitu sebagai berikut:
1) Sebanyak 20 mg ekstrak kering ditambahkan air laut hingga menjadi 10 ml larutan ekstrak untuk mendapatkan kadar 2.000 ppm larutan induk.
2) Dari larutan induk ekstrak tersebut dipipet 500, 250, 50, dan 5 µl ke dalam vial sehingga konsentrasi ekstrak menjadi 1.000, 500, 100, dan 10 µg/ml (ppm) setelah ditambahkan air laut hingga 1 ml.
3) Sebelum dimasukkan larutan ekstrak dan air laut, terlebih dahulu dimasukkan larva udang sebanyak 10 ekor ke dalam vial. Hal ini dilakukan agar konsentrasi tepat dan udang tidak mendapat konsentrasi larutan yang terlalu tinggi sebelum penambahan air laut hingga 1 ml.
4) Setelah 1 hari (24 jam) dilakukan pengamatan dengan cara menghitung jumlah larva udang yang mati.
Analisis Data Analisis Karakteristik Habitat Mikro Tabat Barito
Analisis kualitatif digunakan untuk mendeskripsikan dan menjelaskan data-data hasil eksplorasi. Karakteristik habitat mikro tabat barito yang diamati, meliputi:
a) Jenis-jenis tumbuhan inang dari tabat barito.
b) Kondisi tumbuhan inang (tinggi pohon, tinggi bebas cabang, diameter batang, luas tajuk).
c) Penyebaran, ketinggian dari permukaan tanah dan jumlah individu tabat barito pada setiap tumbuhan inang.
d) Media tumbuh tabat barito pada tumbuhan inangnya. e) Suhu dan kelembaban dimana tabat barito berada. f) Kelerengan, arah lereng dan elevasi.
Untuk menentukan komponen-komponen lingkungan yang mempengaruhi banyaknya individu tabat barito yang menempel pada tumbuhan inangnya dilakukan analisis dengan Principal Component Analysis (PCA). Terdapat 8 variabel karakteristik habitat mikro tabat barito yang digunakan dalam analisis faktor, yaitu (1) tinggi total tumbuhan inang, (2) tinggi bebas cabang tumbuhan inang, (3) diameter pohon, (4) luas tajuk, (5) suhu, (6) kelembaban, (7) elevasi dan (8) kelerengan
Hasil analisis faktor, selanjutnya dianalisis dengan menggunakan regresi linear berganda yang diolah dengan software SPSS 16 dengan hipotesis sebagai berikut:
H0 : Banyaknya individu tabat barito yang menempel pada suatu tumbuhan
tidak dipengaruhi oleh karakteristik habitat mikronya.
H1 : Banyaknya individu tabat barito yang menempel pada pada suatu tumbuhan
dipengaruhi oleh karakteristik habitat mikronya.
Analisis Data Hasil Uji Sifat Kimia Media Tumbuh Tabat Barito Dari Berbagai Jenis Tumbuhan Inang
Analisis dilakukan secara deskriptif dengan membandingkan kandungan kimia media tumbuh tabat barito yang berasal dari berbagai jenis tumbuhan inang. Analisis Data Hasil Uji Kandungan Bioaktif Daun Tabat Barito Dari Berbagai Jenis Tumbuhan Inang
Analisis data hasil uji kandungan bioaktif dilakukan secara deskriptif, dengan membandingkan secara kualitatif kandungan alkaloid, saponin, triterpenoid, steroid, tanin dan flavonoid dari daun tabat barito yang berasal dari berbagai jenis tumbuhan inang.
Analisis Data Hasil Uji Toksisitas Larva Udang Daun Tabat Barito dari Berbagai Jenis Tumbuhan Inang
Analisis data terhadap hasil uji toksisitas larva udang berupa jumlah larva udang yang mati dilanjutkan dengan menghitung nilai mortalitasnya dengan menggunakan rumus berikut:
MA (%) = (N2 : N1) x 100% Keterangan :
MA : Mortalitas teramati (%) N1 : Jumlah larva udang awal
N2 : Jumlah larva udang yang mati setelah pengujian
Kemudian nilai mortalitas teramati yang diperoleh dikoreksi dengan kontrol. Nilai mortalitas terkoreksi ini dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut (Albuntana et al. 2011):
MT = Ma - Mk x 100%
100 - Mk
Keterangan :
MT : Mortalitas teramati yang terkoreksi oleh mortalitas kontrol (%) Ma : Mortalitas teramati (%)
Mk : Mortalitas kontrol (%)
Data mortilitas yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan menggunakan probit analysis method dari Minitab 14 untuk mengetahui Lethal Concentration (LC50) dengan selang kepercayaan 95%. Apabila LC50 < 30 ppm, maka ekstrak
sangat toksik dan berpotensi mengandung senyawa bioaktif antikanker. Meyer et al. (1982) menyebutkan tingkat toksisitas suatu ekstrak yaitu:
LC50 ≤ 30 ppm = Sangat toksik
31 ppm ≤ LC50 ≤ 1.000 ppm = Toksik LC50 > 1.000 ppm = Tidak toksik.
Suatu ekstrak bahan alam berpotensi antikanker dengan uji BSLT apabila nilai LC50 < 1000 ppm (Carballo et al. 2002).
Analisis Interaksi antara Karakteristik habitat Mikro dan Media Tumbuh terhadap Kandungan Bioaktif dan Tingkat Toksisitas Daun Tabat Barito
Analisis dilakukan secara deskriptif dengan menganalisis interaksi yang terjadi antara karakteristik habitat mikro tabat barito dan media tumbuhnya terhadap kandungan bioaktif dan tingkat toksisitas daun tabat barito dari berbagai spesies tumbuhan inang.