Penelitian dilaksanakan di laboratorium Nutrisi dan Makanan Ternak Fapet Unud serta di laboratorium Analitik Unud. Seluruh rangkaian percobaan dari masa persiapan mengumpulkan bahan pakan sampai analisis sampel secara in vitro di laboratorium dilaksanakan selama ± 8 bulan (Maret – Oktober 2015).
3.1. Persiapan
Bahan pakan seperti hijauan dan konsentrat yang digunakan sebagai perlakuan di dapatkan dari wilayah Denpasar maupun kabupaten lain yang ada di Bali. Hijauan pakan dan bahan lain yang digunakan sebagai ransum dikeringkan di bawah sinar matahari terlebih dahulu kemudian dicari bahan keringnya (Dry Matter/DM/BK). Ransum disusun berdasarkan bahan kering dengan empat jenis ransum iso protein 9% dengan level energi berbeda yaitu 2000; 2150; 2300 dan 2450 kkal/kg. Adapun bahan yang digunakan sebagai penyusun konsentrat adalah polar, bungkil sawit, kopra, kulit kacang, kulit kopi, onggok, bekatul, garam, sedangkan hijauan yang digunakan adalah rumput raja.
3.2. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari empat perlakuan dan tiga ulangan.
Keempat perlakuan merupakan empat macam ransum dengan iso protein dan energi yang berbeda sebagai berikut:
- Perlakuan A: ransum dengan protein 9% dan energi 2000 kkal/kg - Perlakuan B: ransum dengan protein 9% dan energi 2150 kkal/kg - Perlakuan C: ransum dengan protein 9% dan energi 2300 kkal/kg - Perlakuan D: ransum dengan protein 9% dan energi 2450 kkal/k 3.3. Peubah yang Diamati
1. Produk fermentasi rumen : pH, kadar NH3 dan VFA total cairan rumen 2. Kecernaan bahan kering dan bahan organik ransum
Fermentasi rumen diamati pada dua waktu yang berbeda yaitu 4 jam fermentasi dan 24 jam fermentasi.
14 3.4. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Inokulan
Pelarutan zat kimia untuk penentuan kecernaan in vitro adalah sebagai berikut : larutan buffer terbuat dari 17,42 gram CH3COOH dan 4,10 gram CH3COONa, 17,42 gram CH3COOH dilarutkan pada aquades sampai volume 1250 ml pada temperatur kamar, kemudian 4,10 gram CH3COONa dilarutkan dengan aquades sampai volume 25 ml pada labu ukur kemudian dikocok sampai homogen. Langkah selanjutnya mencampur larutan CH3COOH dan CH3COONa sampai homogen.
Larutan pepsin dibuat dengan 2,5 gram pepsin dalam gelas erlenmeyer, kemudian ditambahkan HCl 0,1 N sampai volume 1250 ml. Campuran pepsin dan HCl 0,1 N tersebut selanjutnya diaduk dengan “magnetic stirrer”. Mulut labu erlenmeyer ditutup dengan kertas alumunium foil. Setelah larutan pepsin homogen maka larutan pepsin siap untuk digunakan. Larutan inokulan dibuat dengan mengambil cairan rumen 2,5 L yang telah disaring dengan kain muslin yang pada kondisi 39-40oC. Selanjutnya dicampurkan ke dalam larutan buffer di atas, aduk sampai rata, dipertahankan pada suhu 39-40oC dalam penangas air.
2. Kecernaan Bahan Kering dan Bahan Organik in vitro (KCBK dan KCBO) Pengamatan fermentasi secara in vitro dilakukan dalam dua waktu pengamatan yang berbeda yaitu 4 jam dan 24 jam. Metode yang digunakan adalah menurut Minson & Mc Leod Method (1972) yang dimodifikasi. Cara kerja untuk menentukan kecernaan in vitro yaitu: sampel ransum yang telah halus dimasukkan ke dalam tabung in vitro sebanyak 0,2500 g dan ditambah 25 ml cairan rumen buffer McDougall dengan kondisi 40oC, selanjutnya diinkubasikan dalam shakerbath dengan suhu 40oC selama 4 jam dan 24 jam. Setiap jam digoyangkan dan dikeluarkan anginnya. Setelah lama waktu inkubasi yang ditentukan, selanjutnya dikeluarkan dan dipusingkan pada 3500 rpm selama 10 menit.
Substrat akan terpisah menjadi endapan dibagian bawah dan supernatan yang bening berada dibagian atas. Diambil supernatan untuk analisis N-NH3, VFA total dan pH. Substrat yang tersisa digunakan untuk analisis kecernaan bahan kering (BK) dan bahan organik (BO) pada tahap berikutnya. Residu hasil sentrifuse pada kecepatan 3500 rpm selama 10 menit ditambahkan 25 ml larutan pepsin 1: 10.000
15
dengan konsentrasi 0,2% dalam HCl 0,1 N, kemudian diinkubasikan lagi selama 48 jam. Selanjutnya dilakukan hal yang sama seperti prosedur diatas sampai pencucian. Setelah pencucian terakhir, dipindahkan secara kuantitatif residu ke dalam cawan yang telah diketahui bobot kosongnya. Diuapkan dalam forced draught oven sampai kering ±12 jam dan dipindahkan ke oven bahan kering selama 9 jam, didinginkan dalam desikator dan timbang. Kemudian dilanjutkan pembakaran ke dalam tanur sampai sampai diperoleh bobot abu. Kecernaan bahan kering dan bahan organik ransum dapat dihitung dengan rumus :
3. Kadar Amonia (NH3)
Kadar N-NH3 dalam cairan rumen ditentukan dengan metode Phenolhypochlorite melalui pembacaan spectrofotometer menurut Solarzano (1969). Sebanyak 15 ml supernatan dimasukkan ke dalam botol yang sudah berisi 5 tetes asam sulfat pekat, kemudian diencerkan 100 kali. Supernatan yang telah diencerkan ini diambil sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam tabung spektro yang sudah diisi larutan standar. Selanjutnya ditambahkan berturut-turut 0,2 ml larutan phenol; 0,2 larutan natrium nitroprusside; dan 0,5 larutan pengoksidasi.
Pembacaan reaksi warna dilakukan 5 menit setelah penambahan larutan pengoksidasi dengan spectrophotometer.
4. Kadar VFA total
Konsentrasi VFA total. Analisa kadar VFA total dilakukan dengan teknik destilasi uap (General Laboratory Procedure, 1966). Sebanyak 5 ml supernatan contoh cairan rumen dimasukkan ke dalam tabung destilasi yang dipanaskan dengan air mendidih dalam labu penyuling. Tabung segera ditutup rapat setelah
BK sampel (g) – [BK residu (g) – BK residu blangko (g)]
KCBK (%) = --- x 100%
BK sampel (g)
BO sampel (g)– [BO residu (g) – BO residu blangko(g)]
KCBO (%) = --- x 100%
BO sampel (g)
16
ditambahkan 1 ml larutan H2SO4 15%. VFA akan terdesak oleh uap air panas melewati tabung pendingin terkondensasi dan selanjutnya ditampung dalam Erlenmeyer yang sebelumnya telah diisi NaOH 0,5 N sampai volumenya 100 – 300 ml. Kemudian ditambahkan 2-3 tetes indikator fenolptalin untuk selanjutnya dilakukan dititrasi dengan HCl 0,5 N. Titrasi diakhiri pada saat terjadinya titik awal perubahan warna merah muda menjadi bening. Juga dilakukan titrasi blanko terhadap 5 ml NaOH. Kadar VFA total dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
VFA total = (b- s ) x N HCl x 1000/5 mM Keterangan:
b = volume HCl yang digunakan (ml) s = volume titran contoh (ml)
N= normalitas larutan HCl
5. pH Cairan Rumen
Mengukur pH cairan rumen dilakukan setelah fermentasi secara in vitro selesai dengan menggunakan alat pH meter. Sebelumnya pH meter sudah distandarisasi pada pH tujuh. Alat pH meter dimasukkan ke dalam beaker glass yang berisi cairan rumen setelah proses in vitro, dan angka yang muncul pada layar monitor pH meter dicatat sebagai pH cairan rumen.
3.5. Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian ini dianalisis dengan sidik ragam.
Apabila terdapat hasil yang berbeda nyata (P<0,05) antar perlakuan, maka analisis dilanjutkan dengan Duncans pada taraf 5% menurut Steel dan Torrie (1993).
17