Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen ITP-Fateta IPB/SEAFAST Bogor untuk menguji cemaran bakteri patogen pada PJAS, dimulai sejak bulan Januari hingga September 2014.
Bahan dan Peralatan Penelitian
Penelitian dikerjakan dengan bahan utamanya adalah sampel PJAS yang diambil dari delapan SD di kota Bogor. Sampel PJAS yang dianalisis terdiri dari PJAS berbasis daging, PJAS berbasis ikan, PJAS berbasis susu dan PJAS berbasis buah dan sayur. Bahan untuk menganalisis bakteri patogen pada pangan antara lain: Chromocult® Listeria selective agar acc to Ottaviani and Agosti (ALOA),
Buffered peptone water, Singlepath L’Mono, Brain Hearth-Broth, Lactose Broth
(LB), Rappaport-vassiliadis (RV) Tetrathionate Broth (TTB), Hektoen enteric agar (HE), Xylose lysine deoxycholate agar (XLD) dan Bismuth sulfite agar (BSA), Triple sugar iron medium (TSI), Lysine iron agar (LIA), Alkaline Peptone Water (APW), TCBS, Baird Parker Agar (BPA), Lauryl Tryptose Broth (LTB), EC broth dan Eosin methylene blue (EMB).
Alat-alat yang digunakan antara lain adalah inkubator, laminar flow cabinet blender, autoklaf dan timbangan analitik. Selain itu juga digunakan berbagai jenis alat-alat gelas (cawan petri, mikro pipet, labu ukur dan lainnya).
Metodologi
Penelitian dilakukan dalam lima tahap. Kelima tahapan ini meliputi persiapan, identifikasi bahaya, identifikasi sumber cemaran, karakterisasi bahaya. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Diagram alir prosedur percobaan
Karakterisasi bahaya Studi literatur untuk menentukan model dosis respon yang akan digunakan menghitung risiko bakteri patogen pada PJAS
Persiapan Penentuan lokasi tempat pengambilan sampel PJAS
Pengujian PJAS Identifikasi bahaya
Identifikasi sumber cemaran
Identifikasi titik kendali kritis pada PJAS
Penetapan titik kendali kritis pada PJAS dengan bantuan pohon keputusan
Pengujian lingkungan dan penjual/ penjamah PJAS
Persiapan
Sampel PJAS diambil dari delapan SD dari enam Kecamatan di Bogor. Jumlah SD tempat pengambilan sampel setiap kecamatan ditentukan secara proposional berdasarkan data referensi Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan (2012). Tempat pengambilan sampel ditentukan dengan cara melakukan dengan sistem undi.
Pengamatan terhadap tempat pengambilan sampel dilakukan dengan cara melakukan pengamatan terhadap lingkungan pengambilan sampel. Pengamatan tersebut meliputi letak sekolah, kondisi kebersihan, jumlah sekolah dalam satu lokasi, jenis dan jumlah pedagang PJAS.
Identifikasi bahaya bakteri patogen pada PJAS
Pengujian PJAS dilakukan terhadap sampel PJAS yang meliputi PJAS berbasis daging (burger, nugget, sosis), PJAS berbasis ikan (siomay, otak-otak, pempek, baso ikan), PJAS berbasis susu (susu pasteurisasi) dan PJAS berbasis buah dan sayur (buah potong, es kelapa muda). Pengambilan sampel dari setiap pedagang PJAS di setiap SD dilakukan sebanyak dua kali ulangan
Metode analisis yang dilakukan terhadap sampel PJAS yang diambil adalah:
a. L. monocytogenes (BAM 2011)
Deteksi menggunakan metode BAM 2011. Sebanyak 25 g sampel PJAS ditambahkan ke dalam 225 mL Listeria Enrichment Broth selanjutnya diinkubasi selama 4 jam pada suhu 30ºC. Setelah 4 jam ditambahkan selective agent. Media tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam dan 48 jam pada suhu 37ºC. Satu ose larutan diambil dari larutan yang telah diinkubasi selama 48 jam tersebut kemudian digoreskan ke media ALOA. Media ALOA tersebut kemudian diinkubasi selama selama 24 - 48 jam pada suhu 37ºC. Semua koloni yang berwarna biru-hijau dengan opaque halo dihitung sebagai koloni yang diduga L. monocytogenes. 1 – 3 koloni + 250 µL brain heart broth didiamkan selama 1 jam pada suhu 37 ºC, diambil 150 µ L, diteteskan ke lingkaran pada singlepath L’mono strip diamati setelah 30 menit. Dua buah garis merah menunjukkan sampel positif mengandung L. Monocytogenes. L. monocytogenes (ISO 11290-2004)
Metode enumerasi. Sebanyak 25 g sampel PJAS ditambahkan ke dalam 225 mL Buffered peptone water. Selanjutnya 0.1 mL larutan disebarkan ke media Listeria selective agar acc to Ottaviani and Agosti (ALOA). Media tersebut kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37ºC. Selanjutnya dilakukan konfirmasi terhadap koloni yang tumbuh. Semua koloni yang berwarna biru-hijau dengan opaque halo dihitung sebagai koloni yang diduga L. monocytogenes. Konfirmasi dilakukan dengan cara 1 – 3 koloni + 250 µ L brain heart broth didiamkan selama 1 jam pada suhu 37 ºC, diambil 150 µ L, diteteskan ke lingkaran pada singlepath L’mono strip diamati setelah 30 menit. Dua buah garis merah menunjukkan sampel positif mengandung L. monocytogenes.
b. Salmonella spp.(SNI 01-2332.2-2006)
Sebanyak 25 g sampel PJAS ditambahkan ke dalam 225 mL Lactose Broth selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 ± 2ºC. Setelah 24 jam
pindahkan 0.1 mL larutan sampel ke dalam 10 mL Rappaport-vassiliadis (RV) diinkubasi selama 24 jam pada suhu 42 ± 0.2ºC dan 1 mL larutan sampel ke dalam 10 mL Tetrathionate Broth (TTB) diinkubasi selama 24 jam pada suhu 43 ± 0.2ºC. Selanjutnya satu ose larutan digoreskan ke media HE, XLD dan BSA kemudian dinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 ± 2ºC. Setelah diinkubasi selama 24 jam selanjutnya koloni khas Salmonella spp. diambil. Koloni Salmonella spp. yang khas adalah sebagai berikut :
- HE agar, kolini hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella spp. membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwana hitam.
- XLD agar, koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella spp. membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwana hitam.
- BSA, koloni coklat, abu-abu atau hitam, kadang-kadang metalik. Biasanya media sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam (halo effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.
Koloni khas Salmonella spp. tersebut kemudian digoreskan pada permukaan agar miring TSI dan LIA serta ditusukkan pada media tersebut. TSI dan LIA dinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 ± 2ºC dengan membiarkan tutup sedikit kendur untuk mencegah terbentuk H2S berlebih. Pada TSI, kultur Salmonella spp. yang khas memberikan reaksi alkalin (merah) pada goresan agar miring dan asam (kuning) pada tusukan agar tegak. Pada LIA, kultur Salmonella spp. yang khas memberian reaksi alkalin (ungu) pada keseluruhan tabung
c. Vibrio spp.(BAM 2004)
Sebanyak 25 g sampel PJAS ditambahkan ke dalam 225 mL Alkaline Peptone Water selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 ± 2ºC. Setelah 24 jam satu ose larutan digoreskan ke media TCBS kemudian diinkubasi selama selama 24 jam pada suhu 35 ± 2ºC. Koloni V. parahaemolyticus pada TCBS berbentuk bundar, diameter 2 -3mm, berwarna hijau atau hijau kebiruan sedangkan koloni V. cholerae besar, permukaan halus agak datar, bagian tengah buram dan bagian pinggir terang, dan berwarna kuning.
d. S. aureus (SNI 2332.9:2011)
Sebanyak 25 g sampel PJAS ditambahkan ke dalam 225 mL KH2PO4.
selanjutnya disiapkan pengenceran 102 dengan cara 1 mL larutan tersebut ditambahkan ke dalam 9 mL KH2PO4., dilakukan sampai pengenceran 103. Satu mL dari tiap pengenceran dipindahkan ke dalam tiga cawan yang berisi media Baird Parker Agar, Egg yolk dan Tellurit masing-masing 0.4, 0.3 dan 0.3 mL. Inokulum diratakan dengan menggunakan batang gelas bengkok. Cawan dinkubasi selama 48 jam pada suhu diinkubasi pada suhu 35 ± 1ºC. Koloni S. aureus mempunyai ciri-ciri koloni bundar, licin/halus, cembung diameter 2-3 mm, warna abu-abu hingga hitam, disekeliling tepi koloni bening (terbentuk halo). Selanjutnya dilakukan konfirmasi dengan cara inokulasi terduga S. aureus ke dalam 2 mL BHI broth dan inkubasi 18-24 jam pada suhu 35 ± 2ºC. Sebanyak 0.2 – 0.3 mL inokulum tersebut dipindahkan ke dalam tabung steril dan ditambahkan 0.5 mL koagulase plasma kemudian diaduk. Inkubasi dilakukan pada suhu 35 ± 2ºC. Pengamatan dilakukan tiap jam untuk
4 jam pertama dan dilanjutkan hingga 24 jam untuk melihat terbentuknya koagulan. Koagulan yang terbentuk secara padat/solid dan tidak jatuh apabila tabung dibalik dinyatakan positif S. aureus.
e. E. coli (SNI 01.2332.1-2006)
Sebanyak 25 g sampel PJAS ditambahkan ke dalam 225 mL KH2PO4.
selanjutnya disiapkan pengenceran 102 dengan cara 1 mL larutan tersebut ditambahkan ke dalam 9 mL KH2PO4., dilakukan sampai pengenceran 104. Satu mL larutan dari tiap pengenceran dipindahkan ke dalam 3 seri tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham. Tabung-tabung tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu diinkubasi pada suhu 35º±1ºC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Uji pendugaan E. coli dilakukan dengan menginokulasi tabung LTB positif ke tabung-tabung EC yang berisi tabung durham. EC Broth diinkubasi dalam waterbath selama selama 48 jam pada suhu diinkubasi pada suhu 48±2ºC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Uji penegasan E. coli dilakukan mengambil larutan dari tabung EC positif kemudian digoreskan pada EMB agar. Koloni terduga E. coli memberikan ciri yang khas yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. Identifikasi sumber cemaran bakteri patogenpada PJAS
Pengujian sumber cemaran dilakukan terhadap lingkungan dan penjual/penjamah PJAS yang sampel PJAS-nya mengandung bakteri patogen. Pengujian sumber cemaran dilakukan sesuai dengan jenis cemaran :
a. Produk mentah/sebelum pemasakan
Metode pengujian terhadap PJAS mentah/sebelum pemasakan sama dengan metode pengujian yang dilakukan untuk menganalisis sampel PJAS matang. b. Udara (Fardiaz dan Jenie 1989)
Cawan berisi media ALOA, HE, XLD, BSA, TCBS, BPA dan EMBA (disesuaikan dengan bakteri yang ditelusuri) diletakkan selama 30 menit di lingkungan tempat pedagang PJAS berjualan dengan kondisi tutup cawan terbuka. Cawan diinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 35-37ºC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dan membandingkan dengan kontrol positif terhadap koloni yang tumbuh.
c. Peralatan (Carpentier dan Barre 2012)
Metode pengujian terhadap peralatan dilakukan dengan teknik swab. Setelah alat swab menyapu seluruh permukaan peralatan selanjutnya alat swab tersebut dimasukkan ke dalam 10 mL KH2PO4. Tahap selanjutnya 0.1 mL larutan ditambahkan pada cawan yang berisi media ALOA, HE, XLD, BSA, TCBS, BPA dan EMBA (disesuaikan dengan bakteri yang ditelusuri). Cawan diinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 35-37ºC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dan membandingkan dengan kontrol positif terhadap koloni yang tumbuh.
d. Tangan pedagang PJAS (Fardiaz dan Jenie 1989)
Pengujian cemaran pada tangan pedagang PJAS dilakukan dengan cara tiga jari pedagang PJAS ditempelkan pada cawan berisi media ALOA, HE, XLD, BSA, TCBS, BPA dan EMBA (disesuaikan dengan bakteri yang ditelusuri) selama dua detik. Cawan diinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 35-37ºC.
Selanjutnya dilakukan pengamatan dan membandingkan dengan kontrol positif terhadap koloni yang tumbuh.
Identifikasi titik kendali kritis pada PJAS
Identifikasi titik kendali kritis (CCP) pada PJAS pada penelitian ini dilakukan hanya terhadap tahapan proses yang dilakukan pada lokasi penjualan, dan hanya bahaya mikrobiologis yang di analisis menjadi penyebab CCP atau bukan CCP, sementara terhadap bahaya fisik dan kimia hanya dilakukan inventarisir kemungkinan bahaya signifikan yang terjadi. Penentuan titik kendali kritis dilakukan dengan bantuan pohon keputusan penetapan titik kendali kritis pengolahan (CCP). Pohon keputusan penetapan CCP dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Pohon keputusan untuk penetapan CCP (Schothorst 2004)
Ya Tidak Bukan CCP Ya Bukan CCP Tidak CCP
Q1: apakah pada bahan baku terdapat bahaya?
Q2: apakah pengolahan dapat mengurangi jumlah bahaya?
Tidak
Bukan CCP Ya
CCP
Q3: apakah formulasi/komposisi atau struktur produk penting untuk mencegah pertambahan jumlah bahaya?
Tidak Ya
Tidak Ya
Bukan CCP
Tidak Q4: apakah pada tahap ini terjadi pertambahan jumlah bahaya?
Q5: apakah tahapan selanjutnya dapat mengurangi jumlah bahaya?
Q6:apakah tahapan proses ini dapat mengurangi jumlah bahaya?
Ya
Karakterisasi bahaya
Pengkajian karakterisasi bahaya bakteri patogen dilakukan dengan melakukan studi literatur untuk memperoleh model dosis respon yang dapat digunakan untuk memperkirakan risiko terjadinya penyakit akibat mengonsumsi PJAS. Model dosis respon yang dikaji disesuaikan dengan jenis bakteri patogen yang ditemukan pada PJAS. Secara umum model dosis respon yang umum digunakan dalam kajian risiko mikrobiologi, yaitu model eksponensial, beta posion, beta-binomial dan weibull-gamma (Vose 2008).
1. Model eksponensial
Model dosis respon ini merupakan model dosis respon yang sederhana dengan paramater tunggal (FAO/WHO 2004). Probabilitas sakit digambarkan mengikuti persamaan berikut:
Pi = 1- e-rN
Dimana Pi adalah peluang sakit untuk seseorang yang terpapar suatu dosis, r adalah peluang satu sel menyebabkan sakit dan N adalah jumlah mikroba yang tertelan (FAO/WHO 2004).
2. Model Beta poisson
Model dosis respon kedua adalah beta poisson pada model ini probabilitas sakit digambarkan mengikuti persamaan berikut:
Pi = 1- (1 + (N/β)-α
Dimana Pi adalah peluang sakit untuk seseorang yang terpapar suatu dosis,
, dalah parameter model, dan N adalah jumlah mikroba yang tertelan (FAO/WHO 2004).
3. Model Beta-binomial
Model dosis respon ketiga adalah model Beta-binomial. Probabilitas sakit pada model binomial mengikuti persamaan berikut :
Pi = 1- {((Γ (N + β) x Γ (α + β))/ (Γ(α +N + β) x Γ(β)}
Dimana Pi adalah peluang sakit untuk seseorang yang terpapar suatu dosis,
, dalah parameter model, Γ adalah fungsi gamma dan N adalah jumlah mikroba yang tertelan (Vose 2008).
4. Model Weibull-Gamma (WG)
Model dosis-respon keempat adalah model Weibull-Gamma (WG) pada model ini probabilitas sakit digambarkan mengikuti persamaan berikut:
Dimana Pi adalah peluang sakit untuk seseorang yang terpapar suatu dosis,
, dan b adalah parameter model, dan N adalah jumlah mikroba yang tertelan (Farber et al 1996).
Pengolahan data untuk menghitung peluang sakit per sajian dilakukan dengan menggunakan software @RISK, dengan cara sebagai berikut:
1. Penentuan distribusi yang tepat untuk data jumlah bakteri patogen per gram PJAS diperoleh dari hasil analisis cemaran bakteri patogen pada PJAS. Penentuan distribusi dilakukan menggunakan fitting distribution yang terdapat di software @RISK. Jenis distribusi yang diperoleh selanjutnya digunakan pada langkah 2.
2. Penentuan nilai rata-rata dari data jumlah bakteri patogen per gram PJAS. Nilai rata-rata diperoleh dengan menggunakan jenis distribusi pada langkah 1. Selanjutnya ditentukan batas bawah dari data yaitu 0. Batas bawah 0 dipilih karena jumlah cemaran bakteri patogen pada sampel tidak mungkin berjumlah minus. Pada langkah ini diperoleh rata-rata jumlah cemaran bakteri patogen per gram sampel PJAS (cfu/g).
3. Simulasi Monte-Carlo (10.000 iteration). Simulasi Monte-Carlo dilakukan terhadap nilai rata-rata cemaran bakteri patogen per gram PJAS sehingga diperoleh nilai rata-rata cemaran bakteri patogen per PJAS yang telah disimulasikan.
4. Penentuan nilai rata-rata berat PJAS per sajian yang telah disimulasikan. Nilai ini diperoleh dengan melakukan langkah 1-3 dengan menggunakan data berat PJAS per sajian (g).
5. Penentuan dosis bakteri patogen per sajian PJAS. Dosis bakteri patogen per sajian PJAS diperoleh dengan cara mengalikan antara jumlah bakteri patogen per satu gram PJAS (cfu/g) dengan berat PJAS per sajian (g).
6. Simulasi Monte-Carlo (10.000 iteration). Simulasi Monte-Carlo dilakukan terhadap nilai dosis bakteri patogen per gram PJAS sehingga diperoleh nilai dosis bakteri patogen per PJAS yang telah disimulasikan.
7. Peluang sakit akibat bakteri patogen per sajian PJAS diperoleh dengan cara memasukkan nilai dosis bakteri patogen per sajian PJAS ke dalam model dosis respon yang telah dipilih berdasarkan studi literatur.
8. Simulasi Monte-Carlo (10.000 iteration). Simulasi Monte-Carlo dilakukan terhadap peluang sakit bakteri patogen per sajian PJAS sehingga diperoleh peluang sakit bakteri patogen per PJAS yang telah disimulasikan.
