METODE PENELITIAN 3.1.Tujuan Operasional Penelitian
3.3. Metode penelitian
Penelitian yang akan dilakukan adalah studi eksperimental di laboratorium, rancangan acak lengkap (Steel dan Torrie, 1989 ). Data dianalisis secara deskriftif dengan membaca hasil elektroforesis cDNA dan protein.
Bahan dan Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang mencit dari bak plastik beserta kawat penutup, botol air minum, syringe, jarum penyuntik, timbangan hewan, timbangan analitik, alat bedah, tabung spesimen, gelas ukur, corong kaca, test plate, mikroskop binokuler, silet, stereoform, kapas, kertas tissue dan kertas saring, pipet, dan pengaduk, alat elektroforesis RNA dan protein , tabung eppendorf, pipet ukuran dengan berbagai ukuran, alat sentrifugasi, shaker, vortex, alat homogenasi.
30
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit balck-6, 2- methoxyethanol, aquabides, cell lytic M reagent, larutan RNA latter, kit RNAeasy, kit RT-PCR cat 210210, primer GFAP, DNA ladder 100 bp, monoklonal anti bodi GFAP, monokolonal anti Ig G mencit, ethidiumbromid, susu skim, agarose , larutan bradford, larutan BSA, Buffer TAE, larutan AEC, TEMED, Amoniumpersulfat, pakan mencit berupa pellet anak ayam, air minum, dan sekam, larutan buffer, bromfenol biru, protein marker 100 bp, larutan Coomassie brilliant R” 0,05 %, larutan asam asetat glacial 7%, akrilamid, bisakrilamid, larutan fenol, loading buffer gel.
Hewan percobaan
Mencit Mus musculus (Swiss webster) yang digunakan dalam penelitian ini.
Pemeliharaan hewan dilakukan pada temperatur ruang 23-27oC dan kelembaban 83%. Mencit diberi makan dan minum secara ad libitum. Mencit betina yang mencapai kematangan seksual pada umur 10-12 minggu dikawinkan dengan mencit jantan dengan perbandingan 1:1. Adanya vagina plug merupakan tanda telah terjadi kehamilan hari ke nol (Rugh, 1968).
Pengumpulan Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah otak mencit Mus musculus (Swiss webster), yang diperoleh dari Laboratorium Toksikologi dan Puslitbang Departemen Kesehatan. Pengambilan sampel mencit secara acak. Penelitian dilakukan baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol.
Kelompok perlakuan diberi 2-ME secara intraperitoneal dengan dosis 7,5 mmol/kg berat badan, volume penyuntikan 10 ml/kg berat badan. Kelompok kedua adalah kontrol yang hanya diberi aquabides. Pemberian 2-ME dilakukan pada hari
31
kebuntingan ke-10 dan dilakukan uji protein, uji mRNA GFAP otak pada umur kebuntingan 14 hari.
Teknik pengambilan data
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit albino (Mus musculus) Swiss Webster, yang diperoleh Laboratorium Toksikologi dan Puslitbang
Departemen Kesehatan, Mencit jantan dan mencit betina bunting dipelihara secara terpisah.
Pengenceran Primer GFAP
Pembuatan larutan stok primer reverse dan forward GFAP dengan menambahkan 168 µl dH2O dan 214 µl dH2O, ke dalam masing-masing tabung.
Larutan primer yang dipakai pada penelitian ini mempunyai konsentrasi 100 µl.
Dengan mengambil 10 µl larutan stok kemudian ditambah 90 µl dH2O.
Uji RNA
Mencit hamil dibunuh secara dislokasi serviks pada hari kebuntingan ke-14 . Uterus dibedah, lalu dimasukkan ke dalam tabung falkon yang mengandung larutan buffer. Uterus dibedah dan embrio dikeluarkan. Sampel otak diisolasi dibawah mikroskop stereo, kemudian di masukkan ke dalam Nunc cryo tube, yang telah berisi nitrogen cair untuk analisis protein. Sebagian sampel otak embrio UK-14 hari, diletakkan dalam tabung yang berisi RNA-latter, untuk analisis RNA.
Uji RNA serebrum otak, menggunakan RNaesy KIT. Sampel dipindahkan dari tabung yang berisi RNA-later ke tabung homogenasi yang berisi butir keramik . Lalu ditambahkan 700 µl buffer RLT. Homogenasi dengan kecepatan 6.0 M/S, selama 30 menit. Pipet semua supernatan hasil homogenasi, ke tabung eppendorf yang baru, dan ditambah satu volume etanol 70 %, campur dengan cara divortex.
32
Hasil supernatan secara hati-hati dipindahkan ke RNeasy spin column. Semua supernatan disentrifugasi pada 11.000 rpm, temperatur ruang, dan hasil saringan dibuang. 700 µl buffer RW1 ditambahkan kedalam tabung RNeasy column, sentrifus selama 1 menit, 11000 rpm. Buang tabung collecting dan ganti dengan yang baru, lalu tambahkan 500 µl buffer RPE (2x), tutup tabung, sentrifus selama 1 minute, 11.000 rpm, pada temperatur ruang. RNeasy spin colum ditempatkan dalam tabung collecting yang baru ukuran 2 ml dan sentrifugasi dengan kecepatan 11000 rpm, selama 1 minut. 50 µl RNase-free water ditambahkan secara langsung ke dalam RNeasy spin column membrane, untuk melepaskan RNA. Sampel RNA diletakkan dalam refrigator (-20oC) untuk analysis spectrofotometry Bradford. Uji spektrofotometri digunakan untuk menguji kandungan RNA. Sebanyak 3 µl RNA dari larutan sampel otak dimasukkan ke dalam cuvet bradford, sebagai blanko digunakan lautan RNase free water.
Penentuan Kandungan RNA/DNA
Penentuan kadar RNA menggunakan spektrofotometri pada A.260 dan A.
280. Untuk menghitung Indeks kemurnian RNA adalah A260/A280. Jika Indeks di atas 1,75 maka dinyatakan RNA nya murni. Sebagai blanko digunakan akuades steril. Sebanyak 1 µl RNA diencerkan dengan menambah 999 µl ddH2O, sehingga volume mencapai 1000 µl. Kandungan RNA diukur pada absorbansi (A) 280, 260, dan 230. Untuk menghitung konsentrasi atau Kandungan RNA dipalai rumus sebagai berikut:
Konsentrasi RNA = A230 x 40 µg.µl / vol pengenceran Konsentrasi DNA = A 260 x 50 µg. µl / vol pengenceran Reverse Transkriptase-PCR
33
RNA hasil ekstraksi dalam tabung RNAeasy tube di vorteks beberapa menit lalu di sentrifugasi. Sample RNA dibiarkan di dalam es. Pembuatan larutan mix, yang terdiri dari 10 µl one step RT-PCR buffer, 2 µl dNTP mix, 10 µl larutan Q, primer GFAP reverse dan primer GFAP forward masing-masing 3 µl, dan RNase free water 10 µl. Larutan di vortex dan disentrifugasi. Larutan mix sebanyak 50 µl, dimasukkan ke dalam tabung PCR kemudian ditambahkan sampel RNA yang mengandung konsentrasi 2 µg. Untuk mengubah RNA menjadi cDNA, dimasukkan ke dalam thermal cycler selama 30 menit, 50oC. cDNA hasil RT-PCR disimpan dalam es, sambil menunggu thermal cycler untuk memasuki tahap awal aktifasi PCR, 95oC ; 15 menit, denaturasi 1 min pada suhu 94°C, Annealing 1 min selama 68°C, pemanjangan selama 1 min pada suhu 72°C, akhir pemanjangan selama 10 min pada suhu 72°C, dengan siklus 40x. Hasil amflifikasi, cDNA dapat disimpan pada suhu 2–8°C, or at –20°C untuk penyimpanan jangka panjang.
Elektroforesis RNA/DNA
Teknik elektroforesis agarose gel digunakan dalam penelitian ini. Agarose gel yang digunakan adalah agarose 2%. Pemisahan cDNA pada gel agarose berdasarkan pasangan basa, diikuti dengan pemisahan marker 100 base pair. Masing-masing sampel dari 9 µl brain otak fetus UK-14 baik kontrol dan perlakuan, ditambahkan loading buffer. Sebelum running pada 80 V, sampel ditambah tiga Ethidiumbromid ke dalam larutan agarose,. Pipet setiap sampel ke medium agarose, begitu pula dengam markernya. Biarkan sampai terpolimerisasi. gel agarose siap ditransfer ke box foto UV, untuk melihat pita-pita DNA.