g,ffiqz HASIL PENELITIAN

t

DIPA RLTI]..i LEMLIT LNJ

HASIL PENELITIAN

Ekspresi Protein dan mRh[ A glial Jibrifiary ^{acidic protein} (GFAP) cerebrum Mencit Mus musculus (swiss webster)

uk-14 hari akibat induksi 2-Methoxyethanol

OIeh:

Dra. Nurhaida Hafni Lubis, ItLPd"

f)ra. Yulia lrnidayanti, M.Si.

PENELITIAN INI

DIBIAYAI

DANA DIPA RUTIN UNIYERSITAS NEGERI

JAKARTA

TAITLhI ANGGARAN 2OO7 BERDASARKAN SLIRAT

PERJANJIAN PEKERJAA}I PENELITIAN

GB g,ffiqz

DENGAN NOMOR tYu20t0

TANGGAL

; 38/SPK-Kompetensi/L,P/DIPA BLU LINJ : 30 Juni 2010

LEMBAGA PENELITIAN

TINIYf,

RSITAS NEGERI JAKARTA

HASIL PENELITIAN

Ekspresi Protein dan mRNA glial fibrillary acidic protein (GFAP) Cerebrum Mencit Mus musculus (Swiss webster)

uk-14 hari akibat induksi 2-Methoxyethanol

Oleh:

Dra. Nurhaida Hafni Lubis, M.Pd.

Dra. Yulia Irnidayanti, M.Si.

PENELITIAN INI DIBIAYAI DANA DIPA RUTIN UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA TAHUN ANGGARAN 2007 BERDASARKAN SURAT

PERJANJIAN PEKERJAAN PENELITIAN

DENGAN NOMOR : 38/SPK-Kompetensi/LP/DIPA BLU UNJ /VI/2010

TANGGAL : 30 Juni 2010

LEMBAGA PENELITIAN UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

DIPA RUTIN LEMLIT UNJ

1 BAB I PENDAHULUAN 1. 1. Latar Belakang

Plastik adalah salah satu bahan yang dapat kita jumpai di hampir setiap barang, mulai dari botol minum, TV, kulkas, pipa paralon, plastik laminating, gigi palsu, compact disk (CD), kuteks (pembersih kuku), mobil, mesin, alat-alat militer hingga pestisida. Oleh karena itu kita bisa hampir dipastikan pernah menggunakan dan memiliki barang-barang yang terbuat dari plastik.

Industri plastik di Indonesia, memproduksi bahan plastik yang mengandung bahan toksik lebih besar dibandingkan dengan negara Jepang. Data dari Industri Petrokimia Jepang tahun 1998, Jepang telah memproduksi sekitar 30 persen bahan plastik bersifat toksik. Salah satu bahan senyawa yang banyak digunakan dalam perindustrian pembuatan plastik adalah 2-Methoxyethanol (2-ME). Senyawa ini disebut juga ethylene glycol monomethyl ether (EGME), yang banyak digunakan untuk bahan cat, industri kulit, pelarut cat dan vernis, pabrik semikonduktor, dan cairan rem (Hays, et al.,2000), bahkan sebagai bahan platicizer dalam industri plastik yang digunakan untuk pembungkus makanan (Johanson, 2000). Plastik umumnya digunakan untuk berbagai aktivitas manusia, seperti contoh, bahan pembungkus mainan, pipa air dan bahkan digunakan untuk keperluan di bidang kesehatan yaitu sebagai tempat penyimpanan darah untuk transfusi.

Pada dasawarsa terakhir ini, telah banyak dilaporkan adanya dampak negatif dari bahan-bahan kimia pencemar lingkungan. 2-methoxyethanol merupakan salah satu bahan kimia pencemar, yang bersifat teratogenik maupun embriotoksik, baik pada hewan maupun manusia. Gangguan yang ditimbulkan berupa berbagai macam

2

kelainan fetus, gangguan pada sistem saraf pusat.(Colborn et al., 1993 dan Hutchison, 1997). 2-ME dan metabolitnya di dalam tubuh dapat merusak sel dan jaringan. Tubuh dapat terpapar oleh 2-ME melalui udara, air dan tanah (EPA, 1994).

Data laporan sebelumnya, menyebutkan bahwa, beberapa orang telah keracunan 2- ME melalui pernapasan, makanan dan minuman yang terkontaminasi, penetrasi ke dalam kulit secara langsung (Dugard et al., 1984). Sekitar 100.000 orang telah teracuni 2-ME pertahun, dari jumlah tersebut diduga adalah kaum wanita yang masih dalam masa subur atau mampu melahirkan (Scoot et al., 1989). Senyawa 2-ME yang masuk ke dalam tubuh dapat bersifat toksik dan teratogenik, serta dapat menyebabkan cacat kandungan, pada beberapa spesies mamalia (Feuston et al 1990).

Sifat toksisitas dan teratogenik suatu bahan pencemar sangat tergantung pada spesies, dosis, periode pemberian dan masa perkembangan fetus. Proses perkembangan fetus merupakan periode yang sangat sensitif terhadap pemaparan bahan obat, bahan toksik sejenisnya atau bahan-bahan lainnya. Semakin muda umur fetus maka semakin sensitif terhadap bahan yang bersifat toksik. Periode sensitif perkembangan fetus mencit terjadi pada masa organogenesis dan differensiasi. Pada masa tersebut terjadi pembentukan calon organ, kemudian berdifferensiasi menjadi organ. Jika terjadi gangguan kehamilan selama periode tersebut terhadap bahan- bahan yang bersifat toksik, dapat memunculkan kelainan fetus di dalam kandungan.

Sifat teratogenik senyawa 2-ME, disebabkan oleh hasil metabolismenya di dalam sel hati menjadi 2-metoksiasetaldehid (2-MALD), dengan bantuan katalisator alkohol dehidrogenase (ADH). Selanjutnya senyawa 2-MALD akan dioksidasi lagi dengan bantuan enzim aldehid dehidrogenase menjadi asam metoksiasetat (MAA).

Senyawa MAA ini merupakan metabolit utama, dan MAA inilah yang bersifat

3

embriotoksik dan teratogenik (Brown et al., 1984 dan Moslen et al., 1995). Sifat embriotoksik dan teratogenik senyawa MAA telah terbukti pada mamalia, terutama pada masa embrio preimplantasi maupun postimplatasi. Sifat embriotoksik ini sama dengan yang disebabkan oleh senyawa 2-ME (Darmanto et al., 1994). Senyawa 2- ME, selain bersifat teratogenik juga dapat menyebabkan gangguan pada sistem reproduksi. Gangguan yang terjadi terutama berupa kerusakan pada jaringan testis, yang berdampak pada gangguan proses spermatogenesis dan menyebabkan apoptosis spermatosit pada tikus, marmut dan kelinci (Ku et al., 1995; dalam Wine et al., 1997). 2-ME sangat potensial menyebabkan kelainan perkembangan otak yaitu menyebabkan otak terdedah (Ketti et al., 1996 dan Johanson, 2000). Hasil penelitian Prihiyantoro (2004) menyebutkan bahwa 2-ME menyebabkan kelainan pada otak fetus mencit, bila induknya diberi 2-ME. Kelainan otak yang muncul antara lain berupa otak terdedah, penipisan lapisan kortek serebrum, kelainan pola foliasi pada cerebellum. Kelainan-kelainan tersebut diduga disebabkan oleh meningkatnya kematian sel pada neuroepithelium tabung neural. Kematian sel ini, diduga merupakan penyebab terjadinya kegagalan penutupan tabung neural, sehingga terjadi ketidakseimbangan antara proliferasi sel dan kematian sel (Hildebrand, 1999).

Disamping itu kelainan otak juga dipengaruhi oleh beberapa peran protein.

Gangguan ekspresi beberapa protein yang diperlukan untuk penutupan tabung neural akibat pemberian 2-ME, dapat memunculkan terjadinya kelainan perkembangan otak. Hasil penelitian Mebus and Welsch (1989), menunjukkan bahwa pemberian MAA dapat mengganggu ketersedian basa purin dan pirimidin. Hal ini diharapkan dapat mempengaruhi sintesis DNA dan atau RNA, yang pada akhirnya mempengaruhi proliferasi dan differensiasi sel di dalam perkembangan embrio.

4

Berdasarkan hasil tersebut diduga ada beberapa jenis protein tertentu yang berperan dalam penutupan tabung neural dan tidak diekspresikan selama pembentukan tabung neural.

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dalam penelitian ini akan mengungkapkan jenis protein yang berperan selama perkembangan otak. Otak merupakan organ yang paling awal dibentuk tetapi perkembangannya paling akhir.

Perkembangan otak merupakan organ yang penting, terutama serebellum, karena merupakan organ yang memiliki fungsi koordinasi. Kegagalan perkembangan otak akan mengakibatkan gangguan hampir semua fungsi tubuh. Perkembangan calon otak dipengaruhi oleh beberapa faktor. Salah satu diantaranya adalah protein ekstraselular. Glial fibriler acidic protein (GFAP), merupakan protein ekstraseluler dari sel-sel glial. Protein GFAP merupakan kelompok protein filamen intermediet.

Protein ini berperan untuk membentuk jejaring untuk mendukung dan menguatkan sel-sel. Beberapa molekul protein GFAP terikat bersama-sama membentuk filamen intermediet, yang dijumpai di dalam sel-sel astroglia. Sel astroglial merupakan sel pendukung dan pemberi nutrisi bagi sel-sel yang terdpat di dalam otak dan batang spinal. Jika kedua organ tersebut, mengalami kerusakan, maka sel-sel astroglial bereaksi dengan cepat untuk memproduksi protein GFAP. Meskipun fungsi seluruhnya masih belum diketahui, GFAP mungkin berperan dalam pengontrolan bentuk, pergerakan dan fungsi dari sel astroglial. Beberapa peneliti berasumsi bahwa sel-sel astroglial berperan penting dalam berfungsinya sel-sel lain, mencakup sel-sel khusus yang mengelilingi sistem syaraf (oligodendrosit) dan memproduksi mielin serta mempertahankan mielin dalam jangka panjang (http://ghr.nlm.nih.gov/

gene/GFAP).

5

Mengingat angka insiden kelainan otak cenderung meningkat, seperti munculnya autisme, schizophrenia dan keterlambatan mental, Alexander disease, maka akan dilakukan penelitian untuk mengetahui ekspresi protein yang berperan dalam perkembangan otak. Dengan mengidentifikasi jenis protein fungsional ini, maka dapat menggambarkan fungsi protein yang sebenarnya di dalam sel atau jaringan (Ruyani, 2003). Maka akan dilakukan penelitian untuk melihat ekspresi protein GFAP dan level ekspresi mRNA GFAP pada serebrum dalam perkembangan otak secara molekular. Dengan mengetahui level ekspresinya, maka dapat diketahui peranan dari protein GFAP yang sebenarnya di dalam sel atau jaringan. Hasil yang diperoleh akan dilakukan uji lanjut dengan uji immunohistokimia terhadap protein GFAP sebagai bahan disertasi kami.

1. 2. Kajian Masalah

2-methoxyethanol (2-ME), termasuk dalam kelompok glycoether, telah banyak dipergunakan secara luas dalam dunia perindustrian plastik. Senyawa tersebut apabila masuk ke dalam tubuh manusia, akan dimetabolisme menjadi metabolit toksik, dengan bantuan alkohol dan aldehid dehidrogenase (Jindo, et al., 2001). Pengaruh dari 2-ME terhadap kesehatan manusia dan lingkungan tergantung pada jumlah, lamanya dan frekuensi pemaparan, kondisi fisik (Hayati et al., 2005 ).

Meskipun demikian, 2-ME dalam jumlah normal tidak membahayakan lingkungan itu sendiri (EPA, 1994).

Mengingat begitu luasnya penggunaan 2-ME di dalam kehidupan manusia, maka resiko terjadinya cacat janin akibat terpaparnya senyawa 2-ME, akan semakin besar. Senyawa 2-ME, sangat potensial menyebabkan kelainan perkembangan otak

6

yaitu otak terdedah (Darmanto, 1998). Otak adalah organ yang paling penting karena merupakan organ yang memiliki fungsi koordinasi. Kegagalan perkembangan otak akan mengakibatkan gangguan hampir semua fungsi tubuh, karena masa pembentukan organ otak, dibentuk paling awal, namun selesai pembentukannya juga paling akhir. Otak hewan vertebrata berkembang dari jaringan neuroektoderm yang semula berbentuk lempengan dan kemudian mengalami proliferasi, diferensiasi, adhesi dan migrasi, sehingga membentuk sebuah tabung yang disebut tabung neural (Schoenwolf and Smith, 1990). Terpaparnya jaringan yang akan berkembang menjadi calon otak, terhadap bahan yang bersifat toksik maupun teratogenik, akan menyebabkan kegagalan pembentukan tabung neural. Kegagalan ini menyebabkan kelainan yang sangat serius karena bersifat mematikan. Kelainan yang ditimbulkan akibat kegagalan penutupan tabung neural ialah otak terdedah, terjadi pada bagian anterior tabung neural atau spina bifida, yang terjadi pada bagian posterior (Dias dan Partington, 2004).

Perkembangan calon otak dipengaruhi oleh beberapa faktor. Salah satu diantaranya adalah protein ekstraselular. Glial fibriler acidic protein (GFAP), merupakan protein ekstraseluler dari sel-sel glial. Senyawa 2-ME dapat masuk ke dalam tubuh melalui pemaparan pada kulit dan saluran pernapasan (Dugard et al., 1984). Sekitar 100.000 orang teracuni oleh 2-ME pertahun, dari jumlah tersebut diduga adalah kaum wanita yang masih dalam masa subur (Scoot et al., 1989). 2- ME dan metabolitnya di dalam tubuh dapat merusak sel-sel dan jaringan. MAA yang masuk ke dalam tubuh dapat mempengaruhi sintesis DNA dan RNA, sehingga terjadi pula penghambatan sintesis protein (Ellis et al., 1991; dalam Umansky, 1996,). Jadi dapat diasumsikan bahwa jika terjadi penghambatan sintesis GFAP,

7

maka menyebabkan gangguan pembentukan filamen intermediet. Hal ini tentunya akan berdampak terhadap fungsi sel. Fungsi sel yang terganggu, akan berdampak pada sintesis serabut filamen yang abnormal pula, sehingga terganggunya perkembangan otak.

Akhir-akhir ini angka insiden kelainan otak cenderung meningkat, seperti munculnya autisme, schizophrenia dan keterlambatan mental. Mengingat makin meningkatnya insiden kelainan sistem saraf pusat, khusunya di Indonesia, dan masih sedikitnya penelitian molekular dan proteomik, dibidang perkembangan otak, sehingga perlu dilakukan penelitian secara molekular terhadap protein yang berperan dalam perkembangan otak.

1. 3. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah dan kajian masalah maka perlu dirumuskan permasalahan sebagai berikut:

1. Apakah pemberian 2-ME dapat menyebabkan perubahan ekspresi mRNA GFAP dari serebrum embrio mencit Mus musculus Swiss webster pada uk-14 hari ?

2. Apakah pemberian 2-ME dapat menyebabkan perubahan level ekspresi protein GFAP serebrum embrio mencit Mus musculus Swiss webster pada uk-14 hari?

3. Apakah pemberian 2-ME dapat menyebabkan perubahan struktur susunan protein GFAP cerebrum embrio mencit Mus musculus Swiss webster pada uk- 14 hari ?

1. 4. Tujuan Penelitian

1. 4. 1. Tujuan Khusus Penelitian

1. Untuk mengetahui level ekspresi mRNA GFAP serebrum embrio mencit Mus musculus Swiss webster pada uk-14 hari

8

2. Untuk mengetahui perubahan level ekspresi protein GFAP serebrum embrio mencit Mus musculus Swiss webster pada uk-14 hari

3. Untuk mengetahui perubahan struktur susunan protein GFAP cerebrum embrio mencit Mus musculus Swiss webster pada uk-14 hari

1. 4. 2. Tujuan Umum Penelitian

1. Untuk mempelajari mekanisme kelainan otak akibat induksi 2-ME, pada tingkat protein.

2. Untuk mengetahui peranan protein glial fibrillary acidic protein (GFAP) yang terlibat dalam laminasi dan posisioning lapisan serebrum.

1. 5. Manfaat Penelitian 1. 5. 1. Manfaat Teoritis

1. Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai bahan acuan dalam mempelajari mekanisme kelainan otak akibat induksi 2-ME, secara analisis biomolekular dan pendekatan proteomik

2. Penelitian ini diharapkan dapat mengetahui peranan protein GFAP yang terlibat dalam proses perkembangan serebrum akibat induksi 2-ME 3. Penelitian ini di harapkan dapat diketahui perubahan level ekspresi

mRNA dan protein GFAP akibat induksi 2-ME, sebagai bahan pencemar lingkungan sehingga kita dapat mempertimbangkan penggunaannya dalam kehidupan sehari-hari.

1. 5. 2. Manfaat Praktis

2. Peneltian ini diharapkan sebagai dasar konfirmasi untuk pertimbangan penggunaan senyawa 2-ME atau dapat dijadikan pertimbangan untuk pengelolaan limbah yang mengandung senyawa 2-ME di lingkungan.

9

3. Penelitian ini diharapkan dapat dipakai sebagai dasar dalam mencari bahan anti teratogenik atau bahan pembuatan obat pencegah penyakit yang berhubungan dengan malformasi otak dan penyakit neurodegeneratif.

10 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2. 1. Tinjauan Tentang 2-Methoxyethanol 2.1.1. Sifat Fisika dan Kimia 2-ME

Senyawa 2-Methoxyethanol (2-ME) dengan nama lain ethylene glycol monomethyl ether, mempunyai rumus kimia C3H8O2. Ciri-ciri yang dimiliki 2-ME diantaranya yaitu tidak berwarna, mudah terbakar, larut dalam air, mempunyai titik didih 124,6 ^OC dan titik beku 85,1^OC. Senyawa 2-ME dilaporkan banyak digunakan sebagai bahan campuran cat, tinta, percetakan foto, zat anti beku yang ditambahkan pada bahan adiktif pompa hidrolik dan bahan bakar jet (Johanson, 2000).

2.1.2. Metabolisme 2-Methoxyethanol

Prinsip jalur biotransformasi 2-methoxyethanol melibatkan dimetilasi gugus Oksigen (O) yang dilanjutkan dengan oksidasi, dengan membuang gugus aldehyd, untuk membentuk metabolit-metabolit utama yaitu 2-methoxyacetic acid (MAA).

Sekitar 60 % -70% senyawa MAA yang masuk ke dalam tubuh, akan diekresikan di dalam urin tikus. Jalur kedua, hasil dealkalisasi ikatan ether membentuk senyawa 2- methoxyethanol, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 2-methoxyacetic acid. Jalur biotransformasi dan metabolisme 2-methoxyacetic acid tertera pada gambar 2.1.

Sifat toksisitas senyawa 2-ME disebabkan oleh hasil metabolismenya di dalam sel hati menjadi 2-methoxyacetic acid (MAA) dengan bantuan alkoholdehidrogenase (Darmanto, 1998). Senyawa 2-ME sangat potensial

11

menyebabkan kelainan perkembangan otak yaitu menyebabkan otak terdedah (exencephaly). Senyawa 2-ME masuk ke dalam tubuh melalui saluran pernapasan atau kontak langsung dengan kulit. Di dalam tubuh senyawa 2-ME akan dioksidasi menjadi 2-methoxyacetaldehyd (MALD) dengan bantuan enzim alkohol dehidrogenase (ADH). MALD dioksidasi lebih lanjut menjadi asam metoksiasetat dengan bantuan aldehid dehidrogenase. Senyawa methoxyacetic acid (MAA), akan melintasi plasenta dan mengganggu perkembangan fetus, sehingga bersifat toksik di dalam tubuh. Senyawa 2-ME juga dapat diperoleh dari hasil oksidasi Ester ftalat, yang merupakan pelentur utama dalam pembuatan plastik polivinil klorida (PVC), dapat larut dalam plasma darah selama darah tersebut disimpan dalam kantung plastik PVC dan selama pencucian darah (Ruyani et al., 2001).

Gambar 2. 1 Metaboloisme Diethylene glycol dimethyl ether (Daniel et al., 1986; Cheever et al.,1988 dan Toraason et al., 1996; dalam CICADAS 41, 2002.

12

Hasil metabolisme utama Diglema berupa asam methoxyaseticacid (MAA), MAA ini akan ditransfer ke fetus dan merupakan satu satunya metabolit yang dijumpai dalam tubuh fetus (CICADS 41, 2002). Senyawa Glycol ether tidak diakumulasi di dalam tubuh tetapi tersebar diseluruh tubuh, sedangkan metabolitnya MAA diakumulasi di dalam tubuh dan mempunyai waktu paruh 77,1 jam.

2. 2. Tinjauan Tentang Mencit

Klasifikasi Mencit (Mus musculus L.) menurut Storer dan Usinger (1957) adalah sebagai berikut :

Kingdom : Animalia Phylum : Chordata Subphylum : Vertebrata Classis : Mamalia Ordo : Rodentia Familia : Muridae Genus : Mus

Spesises : Mus musculus L.

Mencit termasuk kedalam kelas Mamalia, ordo Rodentia, famili Muridae dan spesies Mus musculus. Mencit mempunyai siklus hidup yang pendek, kemampuan hidup 2,5-3 tahun, mencapai tingkat kedewasaan dan dikawinkan pada umur 8-10 minggu. Masa kebuntingan mencapai umur 18-21 hari dengan siklus birahi 4-5 hari, masa reproduksinya antara 2-14 bulan. Jumlah anak yang dilahirkan berkisar antara 10-14 ekor, dengan masa menyusui selama 21 hari. Mencit termasuk hewan nokturnal, dimana masa kawin terjadi pada sore hari yang dibuktikan dengan adanya sumbat vagina (Rugh,1968).

Perkembangan embrio terjadi setelah fertilisasi, perkembangan embrio terjadi di dalam uterus yang terdiri dari 3 fase yaitu: (1) perkembangan awal, dimulai dari

13

fertilisasi sampai pembentukan lapisan-lapisan germinal (2) Organogenesis dasar (3) Differensiasi jaringan. Setelah terjadi fertilisasi, inti ovum dan sperma membentuk pronuklei jantan dan betina. Selanjutnya pada umur kebuntingan 1 hari, zigot pembelahan menjadi 1-2 sel, di dalam oviduk. Pembelahan terus berlangsung hingga membentuk 2-16 sel, dan bermigrasi dari oviduk menuju uterus. Pada umur kebuntingan 3 hari, sel tersebut memasuki tahap morula. Blastula terbentuk pada umur kebuntingan 4 hari dan umur kebuntingan 4,5 hari terjadi implantasi awal pada dinding uterus (Rugh, 1968). Setelah proses implantasi berjalan dengan sempurna pada umur kebuntingan 6 hari, maka proses organogenesis awal mulai terjadi. Proses organogenesis ditandai dengan terbentuknya tiga lapisan germinal, yaitu ektoderm, endoderm dan mesoderm, pada umur kebuntingan sekitar 7,5 hari.

2.3. Perkembangan dan Pembentukan Tabung Neural

Neurulasi adalah proses pembentukan neural, yang merupakan calon otak.

Proses neurulasi dimulai pada tahap akhir gastrulasi, dimana sudah terbentuk tiga lapisan germinal, yang saling berinteraksi. Formasi pembentukan calon otak dibedakan menjadi dua tahap yaitu tahap pembentukan tabung neural dan tahap diferensiasi tabung neural. Tahap pembentukan tabung neural terdiri dari dua tahapan yaitu tahapan neurulasi primer dan tahap neurulasi sekunder.

Neurulasi primer merupakan tahap pembentukan tabung neural, di mana sel- sel di sekitar neural plate secara langsung akan menjadi sel neural plate dan sel tersebut berproliferasi, invaginasi ke wilayah bagian dorsal, membentuk tabung berongga. Selama proses neurulasi primer, dari lapisan ektoderm akan dibentuk tiga kelompok sel, yaitu sel bagian dalam tabung neural, berkembang menjadi otak dan spinal cord; sel bagian luar berkembang menjadi epidermis dari kulit; dan sel neural

14

crest. Sel neural cerst berasal dari wilayah yang menghubungkan epidermis dan

tabung neural, kemudian bermigrasi ke beberapa tempat. Sel tersebut akan membentuk sel saraf perifer dan ganglia, sel pigmen kulit, beberapa jenis sel lainnya (Gilbert, 2000). Neurulasi terjadi dengan cara yang berbeda di setiap bagian tubuh.

Pada wilayah kepala dan badan, dibagi menjadi empat tahap yang terkadang saling tumpang tindih. Tahap tersebut terdiri dari: 1) pembentukan neural plate, 2) perubahan bentuk sel neuroektoderm, 3) pelekukan neural plate merubah neural plate menjadi neural groove, 4) menutup neural groove menjadi neural tube.

Proses neurulasi dimulai dari signal yang dihasilkan dari mesoderm dorsal ke arah sel-sel di sekitar ektoderm. Signal tersebut menyebabkan sel ektoderm yang berbentuk panjang berubah menjadi sel yang berbentuk kolumnar (gambar 2. 2).

Bentuk sel yang memanjang merupakan bakal atau calon sel-sel neural plate.

Lapisan sel Neural plate ini, terletak memanjang di sepanjang aksis anterior- posterior. Setelah terbentuknya neural plate, bagian sisi kiri dan kanan mengalami

penebalan, bergerak ke arah dorsal membentuk neural fold. Neural groove akan tampak pada bagian tengah dari plete tersebut. Neural fold akan bermigrasi ke arah midline dari embrio, berfusi membentuk neural tube. Lapisan yang menutupi permukaan dorsal dari neural tube adalah ektoderm. Pada saat neural fold berfusi akan dilepaskan sel-sel neural crest.

Pelekukan neural plate melibatkan pembentukan wilayah engsel (hing regions), suatu tempat dimana neural tube akan berhubungan dengan jaringan sekitarnya. Pada region hing, bakal sel-sel epidermal berlekatan dengan sisi lateral dari neural plate, bergerak menuju midline. Sel pada midline neural plate ini disebut sel medial hing points (MHP). Sel MHP ini berasal dari bagian neural plate, hanya

15

bagian anterior dan tengah dari nodus Hensen’s. Notokord yang berada di bawah MHP, menginduksi sel-sel MHP, untuk memperendah bentuk sel yang tinggi menjadi bentuk yang salah satu ujungnya tipis atau tebal. Selain MHP, terdapat dua hing region lainnya, yang terlibat dalam pelekukan neural plate. Region ini disebut

dorso-lateral hing points (DLHPs). DLHPs merupakan tempat perlekatan permukaan ektoderm dengan neural fold (gambar 2. 3 dan 2. 4). Hing region berperan sebagai engsel, agar sel dapat melekuk membentuk seperti tabung, bukan seperti buku yang

A B C

Gambar 2. 2 Perubahan bentuk sel. A. Selapis sel neuroektoderm B. Bentuk sel Neuroektoderm memanjang, sehingga sel berubah menjadi kolumnar C. Filamen aktin berkondensasi di bagian apikal, sehingga terjadi penyempitan di bagian apikal membentuk kumpulan sel yang

berbentuk baji (Van Der Put et al., 2001).

tabung, bukan seperti buku yang melipat. Proses perubahan bentuk sel pada hing region, melibatkan mikrotubul dan mikrofilamen. Proses penutupan neural tube

terjadi di wilayah midline. Pada saat penutupan neural tube di daerah kranial atau leher, sel neural crest yang dilepaskan segera bermigrasi, walaupun neural tube belum menutup. Sementara di wilayah kaudal, sel neural crest tidak bermigarsi, sampai neural tube tertutup sempurna. Proses penutupan neural tube tidak terjadi secara simultan, dimana penutupan di kepala lebih cepat dibandingkan dengan penutupan di wilayah kaudal. Regionalisasi neural tube terjadi sebagai akibat perubahan pada bentuk neural tube. Serangkaian perubahan itu adalah

16

penggelembungan, berupa konstriksi di berbagai bagian kompartemen otak. Pada bagian kaudal, neural tube masih berupa tabung sederhana, yang ramping pada bagian ekornya. Dua ujung neural tube masih terbuka membentuk neuropore anterior dan neuropore posterior. Pada embrio, neural tube terbentuk pada usia kebuntingan 8-10 hari.

Tahap neurulasi sekunder melibatkan pembentukan cord medulla dan berongganya cord medulla menjadi neural tube. Differensiasi neural tube menjadi berbagai sistem syaraf pusat terjadi secara simultan dengan tiga cara yang berbeda.

Secara anatomi neural tube mengalami konstriksi membentuk ruang-ruang otak dan

A. C.

B.

D.

Gambar 2. 3. Skema empat tahap elevasi neural fold. A.sel neuro epitelium

memanjang membentuk seperti sebuah bukit B. pembentukan neural groove C. delaminasi, awal elevasi neural fold D. Pelekukan dibantu oleh DLHPs. (dorsolateral hingepoints), ec, ectoderm; np, neural plate; nf, neural fold (Colas dan Schoenwolf, 2001).

spinal cord. Kontriksi terjadi karena adanya fleksi dan torsi di wilayah kepala, meyebabkan tabung neural yang berbentuk lurus, akan terbagi menjadi lima wilayah

17

otak. Kelima wilayah otak tersebut adalah telensefalon, diensefalon, metensfalon, mesensefalon dan mielensefalon.

Gambar 2. 4 Ilustrasi proses pembentukan neural tube dan peranan hinge point dalam proses neurulasi, ee, ectoderm epidermis ; n, notocord (Colas and Shoenwolf, 2001).

Populasi sel di dalam dinding neural tube menata dirinya untuk membentuk sel-sel otak dan spinal cord. Setelah terbentuk kelima wilayah otak tersebut, calon otak akan berdifferensiasi menjadi otak yang sebenarnya seperti otak dewasa.

Differensiasi juga terjadi pada tingkat selular. Pada dinding-dinding dari tabung neural yang baru saja menutup, tersusun atas sel-sel neuroepitel. Sel sel neuroepitel tersebut terus membelah dengan cepat membentuk banyak sel. Sel-sel tersebut meluas, pada seluruh dinding sel tabung neural dan membentuk lapisan epitel berlapis semu yang tebal (gambar 2.5). Komplek junction pada lumen menghubungkan sel-sel epitel tersebut, sehingga semua sel-sel neuroepitel pada dinding tabung neural akan membentuk lapisan neuroepitelial atau neuroepitelium.

Secara bertahap, beberapa sel akan berhenti membelah dan mulai berdifferensiasi menjadi sel neuroblas dan sel-sel glial. Sel-sel ini merupakan komponen selular

18

Gambar 2. 5. Proses pembelahan sel pada tabung neural. Sel yang bermitosis tedapat berdekatan dengan lumen tabung neural. (B) Scanning electron micrograph menunjukkan tabung neural yang baru dibentuk pada stadium siklus sel yang berbeda beda (Colas and Shoenwolf, 2001)

utama dari sel-sel otak. Mula-mula sel-sel neuroepitelium mulai berdifferensiasi membentuk sel-sel neuroblas, dengan inti bulat besar dan anak inti terwarna gelap (gambar 2.6). Sel-sel neuroblas merupakan sel syaraf muda, segera setelah terbentuk akan bermigrasi ke wilayah atau zona yang berbeda, dari otak yang sedang berkembang. Migrasi dilakukan untuk mengorganisir dirinya membentuk lapisan otak yang berbeda dengan lapisan neuroepitelium. Lapisan yang baru terbentuk disebut lapisan mantel (lapisan intermediet), suatu zona di atas lapisan neuroepitelial. Sekarang lapisan neuroepitelial disebut lapisan ventrikel. Neuroblas merupakan sel saraf muda, yang muncul secara terbatas dari pembelahan sel-sel neuroepitelial pada dinding tabung neural. Pada awalnya sel neuroepitel mempunyai prosesus pusat, yang memanjang sampai ke lumen, disebut dendrit sementra.

19

Gambar 2.6. Asal mula sel saraf dan berbagai jenis sel sel glial

Prosesus ini akan hilang, ketika sel tersebut bermigrasi ke lapisan mantel, dan membentuk neuroblas, yang bulat bersifat sementara dan apolar (gambar 2. 7). Pada differensiasi selanjutnya, dua posesus sitoplama, muncul pada sisi yang berlawanan dari badan sel, membentuk neuroblas bipolar. Prosesus pada ujung sel memanjang dengan cepat membentuk akson primitif, dan proses pada ujung lainnya membantuk prosesus sitoplasma bercabang (dendrit primitif). Sel tersebut dikenal dengan nama neuroblas multipolar, yang berkembang menjadi sel sel saraf atau neuron.

Pembentukan prosesus neurit dan dendrit terjadi apabila neuroblas telah berada pada tempat yang semestinya. Adanya neurit dan dendrit memungkinkan neuron berkomunikasi dengan neuron lainnya melalui sinapsis. Bila telah terbentuk neuroblas, maka sel tersebut akan hilang kemampuanya untuk membelah, sehingga pembelahan neuroblas akan berhenti. Terhentinya proses pembelahan pada sel

20

Gambar 2. 7. Berbagai stadium perkembangan neuroblas

neuroblas, memicu sel-sel neuroepitelium untuk membentuk sel pendukung pada sistem syaraf, yaitu gliablas atau sel glial. Gliablas yang terbentuk, juga akan bermigrasi dari lapisan neuroepitelial ke lapisan intermediet dan marginal. Pada lapisan intermediet, sel gliablas berdifferensiasi menjadi astrosit protoplasma dan astrosit fibriler. Jenis sel pendukung kedua, yang berasal dari gliablas adalah oligodendrosit. Sel ini dijumpai pada lapisan marginal, membentuk pembungkus mielin yang membungkus akson assending dan desending pada lapisan marginal.

Jenis sel pendukung ketiga, adalah mikroglia yang tampak pada sistem syaraf pusat.

Sel ini bersifat fagositosik dan berasal dari sel mesenkim. Pada saat sel-sel neuroepitelium berhenti menghasilakan neuroblas dan gliablas, sel mikroglia berdifferensiasi menjadi sel sel ependim yang berbatasan dengan saluran pusat dari spinal cord. Akhir dari differensiasi dinding tabung neural, terbentuk tiga lapisan yaitu lapisan ependim (ventrikel), lapisan mantel dan lapisan marginal (gambar 2. 8).

Migrasi, diferensiasi dan apoptosis terjadi pada ketiga lapisan ini . Tabung neural yang telah mengalami konstriksi di beberapa tempat, akan berdifferensiasi.

Telensephalon akan berkembang menjadi serebrum atau otak besar. Perkembangan seluler serebrum ditandai dengan berbagai proses yang terjadi pada dinding

21

serebrum, yaitu proliferasi sel, migrasi, laminasi, differensiasi sinaptogenesis dan mielinasi. Pada proses perkembangan serebrum, neuroblas hasil differensiasi dari

Gambar 2. 8. Diferensiasi dinding tabung neural, terdiri dari 3 zona yaitu

ventrikular (ependim), intermediet (mantel), dan marginal. Pada cerebral korteks, migrasi neuroblas dan glioblas membentuk korteks plate yang terdiri dari enam lapisan (Jacobson 1991; dalam Gilbert, 2000).

lapisan neuroepitelial (lapisan ventrikel), harus bermigrasi ketempat yang sangat jauh, ke permukaan luar dari dinding serebrum. Beberapa mekanisme molekular yang perperan penting dalam migrasi dan laminasi, secara langsung diorganisir oleh signal

genetik dan peran dari beberapa protein, sel glial fibriler acidic (Dutta et al., 2005).

Tahap pembentukan lapisan-lapisan korteks pada serebrum, dimulai pada zona

22

ventrikular (lapisan mantel). Tahap proliferasi merupakan tahap yang terjadi pada zona ventrikular. Zona ventrikular telensephalon menghasilkan sel-sel stem neuroblas dan sel glial. Setelah pembelahan motosis selesai, sel neuroblas akan mengalami perubahan dari bentuk multipolar ke bentuk bipolar di dalam zona sub ventrikular. Proses perubahan dari multipolar ke bipolar sangat diperlukan untuk proses migrasinya. Sel neuroblas yang bermigrasi di bantu oleh serabut-serabut radial glial dari zona intermediet (zona pre migrasi) menuju zona kortikal plate (Oshima et al., 2007).

Perubahan neuroblas multipolar ke bipolar sangat diperlukan untuk migrasi sel neuroblas ketempat semestinya. Proses perubahan tersebut, memerlukan CDk5 (Cyclin dependen kinase 5). CDk5 biasanya terekspresi pada sel neuroblas tahap post-mitosis. CDk5 berasosiasi dengan sub unit regulator spesifik-neuron yaitu p35, sehingga mengaktifkan protein kinase. Aktivitas protein kinase dapat merubah struktur dinamik dari sitoskeleton neurofilamen di dalam sel, yang berperan dalam proses sinaptogenesis (Ko et al., 2001). Aktivita sub unit regulator p35 sangat diperlukan untuk pembentukan lapisan korteks dalam perkembangan otak (Oshima et al., 2007). CDk5 merupakan regulator migrasi neuron, yang berhubungan dengan jalur signal ekstraselular.

Tahap migrasi merupakan tahap yang sangat penting, dalam pembentukan sistem saraf, terutama proses laminasi wilayah otak. Migrasi neuroblas dipandu oleh suatu sistem serabut-serabut glial radial yang membentang pada dinding telensephalon yang tebal. Sel-sel serabut glial merupakan sel-sel bipolar, di mana prosesus sitoplasmanya yang pendek, terletak di permukaan zona ventrikular sedangkan, prosesus sitoplasma yang panjang terletak di permukaan pial. Perikarion

23

sel-sel glial radial terletak pada zona ventrikular dan zona sub ventrikular. Agar migrasi berjalan lancar maka sel-sel gliablas fibriler, harus berdifferensiasi menjadi sel radial glial fibriler, dengan bantuan protein vimentin. Pada mencit, proses pembentukan serebral korteks (kortikogenesis), terjadi pada periode embrionik 11- 12 hari. Migrasi sel dalam perkembangan otak terjadi melalui migrasi radial. Migrasi ini merupakan migrasi yang umum terjadi. Sel-sel radial glial fibriler mengandung serabut-serabut yang lentur, terletak di antara zona ventrikular dan permukaan pial, pada sistem syaraf pusat. Hal ini sangat diperlukan untuk memandu migrasi neuroblas dalam perkembangan otak (Tuba et al., 1997). Selama periode premigrasi, sel glial fibriler, mengalami differensiasi menjadi astrosit yang masak. Karakteristik protein di dalam sel astrosit akan digantikan oleh GFAP (Glial Fibriler acidic Protein), merupakan karakteristik protein sitoskeleton yang masak. GFAP berkaitan

dengan migrasi neuroblas. Dari hasil uji immunohistokimia diperkirakan terdapat hubungan antara migrasi neuroblas dan GFAP sel-sel glial selama migrasi (Lois et al., 1996).

Ekspresi GFAP pada sel glial fibriler akan memberikan sinyal untuk memandu sel- sel neuroblas, yang akan memandu migrasi neuroblas ke zona intermediet. Sel neuroblas yang telah bermigrasi dan telah menempati posisinya, segera berdifferensiasi menjadi sel neuron yang masak. Apabila ekspresi protein GFAP terganggu, di duga akan menghambat migrasi sel-sel neoroblas, sehingga perkembangan otak menjadi tidak sempurna. Sel neuron yang masak akan mengekspresikan protein sitoskelton berupa neurofilamen (Nf) dan sel membentuk prosesus dendritik dan neuritik. Pengaturan komposisi Nf neuron sangat diperlukan, Kegagalan pengaturan ini, berpengaruh terhadap ekspresi subunit neurofilamen, dan

24

menyebabkan agregrasi Nf. Hal ini berdampak pada gangguan neurodegeneratif termasuk penyakit Alzeimer sindrom (Julien et al., 1998; Julien, 1999; Strong et al., 2004; dalam Thyagarajan dan Szaro, 2007). Di mana pada penyakit ini, subunit nuerofilamennya kusut dan tidak terartu. Peranan sitoskeleton ini, terutama dalam morfogenesis neuron dari bentuk apolar kebentuk bipolar (Matus, 1988; Robinson dan Anderton, 1988; Riederer,1990; dalam Riederer,1992). Sel neuroblas yang bermigrasi juga akan berdifferensiasi menjadi sel-sel Cajal-Retzius di zona subplate (Sp). Migrasi berhenti tepat di bawah sel Cajal-Retzius, pada zona marginal, sehingga membentuk lapisan kortek plate (Cp). Proses migrasi dan posisionoing sel neuroblas dipengaruhi oleh beberapa protein matriks ekstraselular dan intraseluler.

Ekspresi protein pada setiap lapisan-lapisan otak berbeda beda. Proses posisionong sel pada zona ventrikel otak, salah satunya yang sudah diketahui, dipengaruhi oleh protein reelin. Protein Reelin disintesis oleh sel Cajal-Retzius yang berlokasi di zona marginal dari korteks cerebral (Dutta, 2005). Apabila sintesis protein reelin terganggu maka sel neuron pada lapisan Subplate akan terakumulasi di wilayah zona marginal membentuk zona Superplate (Spp). Sel neuron cortical plate tidak bermigrasi ke lapisan subplate dan terakumulasi di zona marginal (gambar 2. 9).

25

Gambar 2. 9. Skema migrasi sel neuron pada cerebrum dan proses laminasi Cortical plate (Cp), Intermediate zone (Iz), Ventricular zone (Vz), Superplate (Spp), Subplate (Sp)(Dutta, 2005).

2.4. Glial Fibriler Acidic Protein dan Peranannya dalam perkembangan Otak Glial fibrilar asidic protein, merupakan protein filamen intermediet, yang

terdapat pada sitoskeleton protoplasm dan serabut-serabut sel-sel astroglial. Peran GFAP yang paling penting adalah dalam perkembangan sistem syaraf pusat dan membentuk jalinan yang mendukung dan menguatkan sel. GFAP disintesis oleh sel- sel radial glial, sel-sel yang terdapat di jaringan ikat sistem syaraf pusat (Oudega dan Marani, 1991). Sel glial radial atau astroglial, merupakan sel pendukung dan pemberi nutrisi bagi perkembangan otak. Bila terjadi kerusakan pada sistem syaraf, maka sel-sel astrosit akan menjadi reaktif dan menunjukkan ekspresis GFAP dan vimentin yang rendah (Pekny et al., 1999). Rendahnya ekspresi GFAP pada sel astrogial reaktif disebabkan oleh kurangnya filamen intermediet dan sl-sel glial kurang terorganisir, bahkan dari laporan Wilhelmsson et al., 2004, menyatakan bahwa pada sel-sel astroglial reaktif, tidak mengekspresikan GFAP dan vimentin.

Keadaan ini diikuti oleh regenerasi sinaptik yang luar biasa. Keadaan sel astroglial reaktif ini, menyebabkan sel tersebut, tidak mampu mengatur reseptor endotelin B.

Jadi diperkirakan pengaturan reseptor endotelin tersebut sangat bergantung pada protein filamen intermediet. Astroglial reaktif itu sendiri berperan sebagai barier, penghambat neuroregenerasi dan pertumbuhan neurit. Dengan kata lain astroglial reaktif, menyediakan substrat yang sesuai untuk pertumbuhan akson kembali ((Rider et al., 1997; dalam Wilhelmsson et al., 2004). Oleh karena itu pengaturan kembali filamen intermediet astroglial merupakan tahap yang paling penting sekali dalam pengaktifan astroglial (Pekny et al., 1999). Pada astrosit reaktif, memiliki beberapa

26

ciri , yaitu astrosit mengalami hipertropi pada prosesusnya dan hiperplasia (Silver and Miller, 2004; dalam Wilhelmsson et al., 2004). Keadaan yang demikian biasanya diikuti dengan penyakit neurodegeneratif, stroke, tumor dan neurotoma (Wilhelmsson et al., 2004).

Seperti yang telah diketahui bahwa diferensiasi neuron dan pengorganisasian struktur otak, salah satunya dipengaruhi oleh kerja sama sel-sel astroglial yang berada disekitarnya, baik secara temporal atau spatial. Sel astroglial adalah sel-sel glial yang terdapat di dalam jaringan ikat sistem syaraf pusat. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa mekanisme kerja sel-sel glial adalah mengontrol pergerakan seluler dengan cara memberikan substrat yang sesuai, untuk migrasi sel-sel neuron dewasa, membentuk jalur serabut melalui pembentukan suatu struktur matriks dan memandu pertumbuhan akson. Peran sel astroglial lainnya, oligodendrosit, adalah menghasilkan lapisan mielin dan memetabolisme neuron. Peranan sel-sel glial, oleh karena peran protein vimentin dan GFAP dalam proses diferensiasi sistem syaraf pusat adalah sama pentingnya (Oudega dan Marani, 1991).

Pada masa perkembangan, sel glial yang paling awal muncul adalah sel-sel glial radial. Sel tersebut berperan dalam memandu migrasi neuron-neuron, dan juga untuk pertumbuhan akson serta neurit (Mc Call et al., 1996). Pada sistem syaraf dewasa, astroglial berperan sebagai struktrur pendukung bagi sel-sel disekitarnya, mengatur level ion dan neurotransmitter di dalam cairan ekstraseluler, dan menghasilkan faktor pertumbuhan pleiotrophik. Dengan cara demikian, astroglial, dapat mempengaruhi sifat-sifat fisiologis dari sel-sel neuron, yang berada di sekitarnya. Sehingga dapat dikatakan bahwa sel astroglial yang masak, dapat mempengaruhi perkembangan oligodendrosit dan endotelium. Pada sel astroglial

27

yang telah berdifferensiasi, biasanya akan mensintesis protein filamen intermediet yaitu Glial Fibriler Acidic Protein (GFAP). Sedangkan pada prekursor astroglial awal, mengekspresikan protein vimentin. Protein ini berperan untuk proses neurogenesis dan pertumbuhan sel astroglial itu sendiri. Vimentin juga diekspresikan oleh prekursor sel-sel neuron. Pada prekursor neuron, vimentin berperan untuk merangsang pertumbuhan sel-sel neuron, kemudian setelah memasuki tahap differensiasi, ekspresi vimentin akan diganti oleh protein neurofilamen (Lois et al., 1996).

Neuron pada sistem syaraf pusat berasal dari zona ventrikular dan zona subventrikular. Neuron tersebut akan bermigrasi untuk mencapai tujuan akhir, di mana mereka berdifferensiasi untuk menjadi sel-sel neuron. Bentuk migrasi neuron ada dua jenis, yaitu migrasi radial, di mana neuron muda akan memanjat atau merambat pada batang sel-sel radial glial dan migrasi tangensial, di mana sel-sel bergerak paralel pada permukaan ventrikel otak, tegak lurus pada serabut-serabut sel-sel radial glial. Sel-sel radial glial ini berperan dalam memberikan lingkungan yang sesuai untuk migrasi, memberikan arah migrasi menuju tempat akhir, menyatukan sel neuroblas dengan jalur migrasinya dan memisahkan sel-sel yang bermigrasi dari lingkungan sekitarnya. Selama perkembangannya, migrasi prekursor neuron pada otak mencit dewasa berbeda-beda. Migrasi dapat terjadi secara sendiri- sendiri, berkelompok atau gabungan keduanya. Dengan adanya jalur migrasi ini, memberikan sejumlah prekursor neuron, hanya melintasi jalur migrasinya. Migrasi ini terjadi dengan kecepatan 30 µm/h. Proses migrasi sel-sel neuron sangat sensitiv terhadap perubahan fisik, bahan kimia, mutasi genetik. Gangguan jalur migrasi sel- sel neuron pada serabut glial radial atau gangguan faktor ekstraseluler atau gangguan

28

pada sel-sel Cajal-Retzius cells, merupakan hal yang masih perlu dipertimbangkan untuk migrasi neuronal. Migrasi yang terhenti atau berlebihan, dapat menyebabkan neuron berdifferensasi dalam posisi hetertopik. Gangguan migrasi ini diyakini merupakan penyebab terjadinya malformasi otak dan lebih khusus abnormalitas struktur dan fungsi serebral (Sun et al.,2002). Di samping migrasi, mutasi pada gen GFAP juga dapat menyebabkan gangguan. Mutasi pada gen GFAP, mengubah urutan asam amino yang digunakan untuk membuat protein GFAP. Satu atau beberapa perubahan asam amino, dapat merubah struktur protein GFAP. Perubahan protein GFAP akan berdampak pada gangguan pembentukan filamen intermediet normal. Sebagai hasilnya protein GFAP terakumulasi di dalam sel-sel astroglial, sehingga membentuk serat Rosenthal, yang dapat merusak fungsi sel (http://ghr.nlm.nih.gov/gene/GFAP).

29 BAB III

METODE PENELITIAN 3.1.Tujuan Operasional Penelitian

1. Untuk mengetahui ekspresi mRNA glial fibriler acidic protein pada serebrum mencit pada uk-14 hari, akibat induksi 2-ME.

2. Untuk mengetahui ekspresi protein glial fibriler acidic protein yang terlibat dalam perkembangan serebrum mencit pada uk-14 hari, akibat induksi 2-ME.

3.2.Tempat dan Waktu Penelitian :

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Universitas negeri Jakarta, Laboratorium Toksikologi dan Puslitbang Departemen Kesehatan. Waktu Penelitian dimulai bulan Maret sampai November 2010.

3.3.Metode penelitian

Penelitian yang akan dilakukan adalah studi eksperimental di laboratorium, rancangan acak lengkap (Steel dan Torrie, 1989 ). Data dianalisis secara deskriftif dengan membaca hasil elektroforesis cDNA dan protein.

Bahan dan Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang mencit dari bak plastik beserta kawat penutup, botol air minum, syringe, jarum penyuntik, timbangan hewan, timbangan analitik, alat bedah, tabung spesimen, gelas ukur, corong kaca, test plate, mikroskop binokuler, silet, stereoform, kapas, kertas tissue dan kertas saring, pipet, dan pengaduk, alat elektroforesis RNA dan protein , tabung eppendorf, pipet ukuran dengan berbagai ukuran, alat sentrifugasi, shaker, vortex, alat homogenasi.

30

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit balck-6, 2- methoxyethanol, aquabides, cell lytic M reagent, larutan RNA latter, kit RNAeasy, kit RT-PCR cat 210210, primer GFAP, DNA ladder 100 bp, monoklonal anti bodi GFAP, monokolonal anti Ig G mencit, ethidiumbromid, susu skim, agarose , larutan bradford, larutan BSA, Buffer TAE, larutan AEC, TEMED, Amoniumpersulfat, pakan mencit berupa pellet anak ayam, air minum, dan sekam, larutan buffer, bromfenol biru, protein marker 100 bp, larutan Coomassie brilliant R” 0,05 %, larutan asam asetat glacial 7%, akrilamid, bisakrilamid, larutan fenol, loading buffer gel.

Hewan percobaan

Mencit Mus musculus (Swiss webster) yang digunakan dalam penelitian ini.

Pemeliharaan hewan dilakukan pada temperatur ruang 23-27^oC dan kelembaban 83%. Mencit diberi makan dan minum secara ad libitum. Mencit betina yang mencapai kematangan seksual pada umur 10-12 minggu dikawinkan dengan mencit jantan dengan perbandingan 1:1. Adanya vagina plug merupakan tanda telah terjadi kehamilan hari ke nol (Rugh, 1968).

Pengumpulan Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah otak mencit Mus musculus (Swiss webster), yang diperoleh dari Laboratorium Toksikologi dan Puslitbang Departemen Kesehatan. Pengambilan sampel mencit secara acak. Penelitian dilakukan baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol.

Kelompok perlakuan diberi 2-ME secara intraperitoneal dengan dosis 7,5 mmol/kg berat badan, volume penyuntikan 10 ml/kg berat badan. Kelompok kedua adalah kontrol yang hanya diberi aquabides. Pemberian 2-ME dilakukan pada hari

31

kebuntingan ke-10 dan dilakukan uji protein, uji mRNA GFAP otak pada umur kebuntingan 14 hari.

Teknik pengambilan data

Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit albino (Mus musculus) Swiss Webster, yang diperoleh Laboratorium Toksikologi dan Puslitbang

Departemen Kesehatan, Mencit jantan dan mencit betina bunting dipelihara secara terpisah.

Pengenceran Primer GFAP

Pembuatan larutan stok primer reverse dan forward GFAP dengan menambahkan 168 µl dH2O dan 214 µl dH2O, ke dalam masing-masing tabung.

Larutan primer yang dipakai pada penelitian ini mempunyai konsentrasi 100 µl.

Dengan mengambil 10 µl larutan stok kemudian ditambah 90 µl dH2O.

Uji RNA

Mencit hamil dibunuh secara dislokasi serviks pada hari kebuntingan ke-14 . Uterus dibedah, lalu dimasukkan ke dalam tabung falkon yang mengandung larutan buffer. Uterus dibedah dan embrio dikeluarkan. Sampel otak diisolasi dibawah mikroskop stereo, kemudian di masukkan ke dalam Nunc cryo tube, yang telah berisi nitrogen cair untuk analisis protein. Sebagian sampel otak embrio UK-14 hari, diletakkan dalam tabung yang berisi RNA-latter, untuk analisis RNA.

Uji RNA serebrum otak, menggunakan RNaesy KIT. Sampel dipindahkan dari tabung yang berisi RNA-later ke tabung homogenasi yang berisi butir keramik . Lalu ditambahkan 700 µl buffer RLT. Homogenasi dengan kecepatan 6.0 M/S, selama 30 menit. Pipet semua supernatan hasil homogenasi, ke tabung eppendorf yang baru, dan ditambah satu volume etanol 70 %, campur dengan cara divortex.

32

Hasil supernatan secara hati-hati dipindahkan ke RNeasy spin column. Semua supernatan disentrifugasi pada 11.000 rpm, temperatur ruang, dan hasil saringan dibuang. 700 µl buffer RW1 ditambahkan kedalam tabung RNeasy column, sentrifus selama 1 menit, 11000 rpm. Buang tabung collecting dan ganti dengan yang baru, lalu tambahkan 500 µl buffer RPE (2x), tutup tabung, sentrifus selama 1 minute, 11.000 rpm, pada temperatur ruang. RNeasy spin colum ditempatkan dalam tabung collecting yang baru ukuran 2 ml dan sentrifugasi dengan kecepatan 11000 rpm, selama 1 minut. 50 µl RNase-free water ditambahkan secara langsung ke dalam RNeasy spin column membrane, untuk melepaskan RNA. Sampel RNA diletakkan dalam refrigator (-20^oC) untuk analysis spectrofotometry Bradford. Uji spektrofotometri digunakan untuk menguji kandungan RNA. Sebanyak 3 µl RNA dari larutan sampel otak dimasukkan ke dalam cuvet bradford, sebagai blanko digunakan lautan RNase free water.

Penentuan Kandungan RNA/DNA

Penentuan kadar RNA menggunakan spektrofotometri pada A.260 dan A.

280. Untuk menghitung Indeks kemurnian RNA adalah A260/A280. Jika Indeks di atas 1,75 maka dinyatakan RNA nya murni. Sebagai blanko digunakan akuades steril. Sebanyak 1 µl RNA diencerkan dengan menambah 999 µl ddH2O, sehingga volume mencapai 1000 µl. Kandungan RNA diukur pada absorbansi (A) 280, 260, dan 230. Untuk menghitung konsentrasi atau Kandungan RNA dipalai rumus sebagai berikut:

Konsentrasi RNA = A230 x 40 µg.µl / vol pengenceran Konsentrasi DNA = A 260 x 50 µg. µl / vol pengenceran Reverse Transkriptase-PCR

33

RNA hasil ekstraksi dalam tabung RNAeasy tube di vorteks beberapa menit lalu di sentrifugasi. Sample RNA dibiarkan di dalam es. Pembuatan larutan mix, yang terdiri dari 10 µl one step RT-PCR buffer, 2 µl dNTP mix, 10 µl larutan Q, primer GFAP reverse dan primer GFAP forward masing-masing 3 µl, dan RNase free water 10 µl. Larutan di vortex dan disentrifugasi. Larutan mix sebanyak 50 µl, dimasukkan ke dalam tabung PCR kemudian ditambahkan sampel RNA yang mengandung konsentrasi 2 µg. Untuk mengubah RNA menjadi cDNA, dimasukkan ke dalam thermal cycler selama 30 menit, 50^oC. cDNA hasil RT-PCR disimpan dalam es, sambil menunggu thermal cycler untuk memasuki tahap awal aktifasi PCR, 95^oC ; 15 menit, denaturasi 1 min pada suhu 94°C, Annealing 1 min selama 68°C, pemanjangan selama 1 min pada suhu 72°C, akhir pemanjangan selama 10 min pada suhu 72°C, dengan siklus 40x. Hasil amflifikasi, cDNA dapat disimpan pada suhu 2–8°C, or at –20°C untuk penyimpanan jangka panjang.

Elektroforesis RNA/DNA

Teknik elektroforesis agarose gel digunakan dalam penelitian ini. Agarose gel yang digunakan adalah agarose 2%. Pemisahan cDNA pada gel agarose berdasarkan pasangan basa, diikuti dengan pemisahan marker 100 base pair. Masing- masing sampel dari 9 µl brain otak fetus UK-14 baik kontrol dan perlakuan, ditambahkan loading buffer. Sebelum running pada 80 V, sampel ditambah tiga Ethidiumbromid ke dalam larutan agarose,. Pipet setiap sampel ke medium agarose, begitu pula dengam markernya. Biarkan sampai terpolimerisasi. gel agarose siap ditransfer ke box foto UV, untuk melihat pita-pita DNA.

3.4.Teknik Analisa

34

Teknik analisa data yang dipakai dalam tahap penelitian ini adalah analisis kualitatif terhadap ekspresi mRNA GFAP serebrum yang dibandingkan dengan kontrol.

35 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Hasil ekspresi gen cDNA secara elektroforesis pada otak embrio mencit Swiss webster, menggunakan primer GFAP, tertera pada gambar 4.1. Baik kontrol maupun perlakuan tidak menunjukkan adanya ekspresi cDNA. Penelitian ini dilakukan sebanyak 3 x elektroforesis dengan konsentrasi agaros 2 %. Yang tampak pada gambar hanya ekspresi marker DNA dengan ukuran 100 bp.

Gambar 4.1. Hasil elektroforesis cDNA otak embrio kontrol dan perlakuan uk14 hari dari induk yang diberi 2-Methoxethanol dengan dosis 7,5 mmol/kg berat badan.

Hasil perhitungan Kandungan RNA yang didapat dilakukan dengan alat spektrofotometri, diperoleh data sebagai berikut:

36

Tabel 1. Hasil perhitungan dengan spektrofotometri terhadap kandungan RNA dan cDNA otak mencit

Gambar 4. 2. Jumlah kopi cDNA untuk ptotein-protein otak embrio normal UK-10 hari hasil Real Time RT-PC

A.230 (1)

A.230 (2)

A.260 (1)

A.260 (2)

A.280 (1)

A.280

(2) Konten RNA Konten cDNA Kontrol uk-14 0,126 µg 0,105 µg 0,096 µg 0,197 µg 0.94 µg 0.067 µg 4,62 µg 7,325 µg Perlakuan uk-14 0,010 µg 0.202 µg 0,27 µg 0.130 µg 0,28 µg 0,346 µg 4,24 µg 10 µg

4.2. Pembahasan

Perkembangan Otak melibatkan berbagai peristiwa yang mencakup proliferasi sel epitel dan migrasi prekursor neuron-neuron ke tempat semestinya pada tabung neural (Jacobson, 1991, dalam Götz et al.,1996). Interaksi neuron dan sel glial, berperan penting dalam proses migrasi tersebut. Dalam hal ini protein-protein matriks ekstraselular yang memperantarai proses migrasi dan proliferasi. Dari hasil elektroforesis menunjukkan bahwa baik pada kontrol maupun perlakuan tidak menunjukkan adanya ekspresi cDNA GFAP. Seperti yang telah diketahui bahwa diferensiasi neuron dan pengorganisasian struktur otak, salah satunya dipengaruhi oleh kerja sama sel-sel astroglial yang berada disekitarnya, baik secara temporal atau spatial. Sel astroglial adalah sel-sel glial yang terdapat di dalam jaringan ikat sistem

syaraf pusat. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa mekanisme kerja sel-sel glial adalah mengontrol pergerakan seluler dengan cara memberikan substrat yang sesuai, untuk migrasi sel-sel neuron dewasa, membentuk jalur serabut melalui pembentukan suatu struktur matriks dan memandu pertumbuhan akson. Dengan demikian kami menduga bahwa tidak adanya ekspresi cDNA GFAP baik pada kelompok kontrol maupun perlakuan kemungkinan GFAP memang belum disintesis. Hal ini mungkin disebabkan oleh sel-sel memang masih berada dalam tahap proliferasi, dan migrasi, sehingga lebih mengekspresikan protein selain GFAP. Pada penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa pada otak embrio uk-12 hari mengekspresikan cDNA protein vimentin yang sangat tinggi. Protein ini terekspresi pada sel-sel yang sedang membelah. Vimentin dijumpai pada stadium embrionik, pada sel-sel glial immature, jaringan yang mengalami kerusakan dan sel-sel progenitor multipotensial.

Data penelitian kami didukung oleh hasil penelitian Imamoto (1985) yang menyatakan bahwa pada umur embrio umur 9 hari, 14 hari dan 21 hari mempunyai jumlah sel glial yang immature sekitar 53,3% ; 40,7 % dan 19,5%. Ekspresi GFAP

vi

terjadi sekitar 3 hari setelah lahir pada mencit. Jadi kami menduga bahwa pada penelitian kami bahwa tidak terekspresinya GFAP, kemungkinan disebabkan sel-sel masih berada pada tahap immature. Karena pada uk-14 hari baik pada kontrol dan perlakuan tidak menampakkan ekspresi GFAP. Jadi pemberian 2-Methoxyethanol pada embrio uk-10 hari, menyebabkan sel-sel glial kembali berrediffrensiasi menjadi bentuk immature dan kemungkinan lebih mengekpresikan protein vimentin. Biasanya begitu ekspresi vimentin mulai menurun maka akan segera digantikan dengan ekspresi GFAP.

Seperti yang telah diketahui bahwa pembentukan otak terjadi paling awal namun perkembangan dan differensiasinya terjadi paling akhir. Sesuai dengan peran dari GFAP yaitu untuk differensiasi otak, maka kami menduga kemungkinan tidak terekspresinya GFAP pada uk-14 karena memang belum diperlukan. Hal ini tampaknya berhubungan dengan fungsi seluler selama perkembangan embrionik (Ruyani, 2008).

Mengingat senyawa 2-ME diberikan pada induk bunting uk-10 hari, maka level ekspresi cDNA protein GFAP otak embrio kontrol dan perlakuan pada uk-14 hari, tidak berpengaruh.

vi BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1.Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat ditarik kesimpulan bahwa dosis tunggal 2-ME 7,5 mmol/kg berat badan yang diberikan secara intraperitoneal pada uk-10 hari, tidak menyebabkan perubahan ekspresi mRNA GFAP. Penelitian ini hanya terbatas pada ekspresi mRNA karena keterbatasan dana penelitian.

5.2. Saran

Adanya penelitian ini berguna sebagai bahan informasi ilmiah tentang ekspresi GFAP. Penelitian ini masih belum selesai, perlu diuji lebih lanjut ekspresi dari GFAP pada uk-15 sampai dengan postnatal 3 hari. Disamping itu perlu uji lanjut terhadap keberadaan protei GFAP, apakah sudah terekspresi sejalan dengan ekspresi mRNA GFAP.

vi

DAFTAR PUSTAKA

Brown, N. A., Holt, D., and Webb, M., 1984, The Teratogenicity of Methoxyacetic Acid in The Rat, Toxicology Letter, Vol. 22: 93-100.

Colas, J. F., and Schoenwolf, G.C., 2001. Towards a Cellular and Molecular Understanding of Neurulation. Develop Dinamics 221:117–145 (2001).

Concise International Chemical Assessment Document 41 (CICADS 41), WHO.

http://www.inchem.org/document/cicads/cicads41.htm

Colborn, T., Vom S.F., Soto A.M., 1993, Developmental effects of chemicals in wildlife and humans. Environ Health Perspect, 101: 378-384.

Darmanto W, Sudarwati S and Sutasurya LA. 1994. Effects of methoxyacetic acid on prenatal development of mice. Environ Med 38: 25-28.

Darmanto W., 1998. Efek 2-methoxyethanol terhadap pembentukan somite dan kelainan rangka aksial pada mencit. Proceeding Temu Ilmiah VII, Hiroshima, Japan : p.19-22.

Dias, M.S. and Partington, M., 2004. Embryology of Myelomeningocele and Anencephaly. Neurosurg Foc. Vol. 16.

Dutta, S., Ghosh, S., Gangopadhyay, P. K., and Usha, R. 2005. Role of Reelin in The Development of Cerebral Cortex. J the Cell and Tissue resch. Vol. 2. 497- 505.

Dugard, PH, Walker M, Mawdsley SJ, Scott RC. 1984. Abssoption of some glycol ethers through human skin in vitro. Environ Health Perspect; 57: 193-197.

Feuston MH, Kerstetter SL, and Wilson PD. 1990. Teratogenicity of 2- methoxyethanol applied as a single dermal dose to rats. Fund Appl Toxicol; 15: 448-456.

Gilbert, S. F., 2000, Development Biology, sixth edition, Sinauer Associates, Inc.

Hayati, A., et al, 2005. Spermatozoa Motility And Morphological Recovery Process In Mice (Mus musculus) After the Induction of 2-Methoxyethanol. Folia Medica Indonesiana. Vol. 41:90-95.

Hays, S. M., Elswick, B. A., Blumental, G. M., Welsch, F., Conolly, R. B., and Gargas, M. L. (2000).Development of physiologically based Pharmaco- kinetic model of 2-methoxyethanol and 2-methoxyacetic acid disposition in pregnant rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 163, 67–74

Hildebrand, J.D., and Doriano P. (1999). Shroom, a PDZ domain-contacting actin- binding protein, is required for neural tube morphogenesis in mice. Cell 99, 485-497.

vi

Hutchison JB. 1997. Gender-specific steroid metabolism in neuro differentiation.

Cell Mol. Neurbiol. 17: 603-625.

Imamoto, K., Astrocytal Changes in White Matter of Jimpy Mice: Immuno- histochemistry Using Antisera to Glial Fibriler Acidic Proteoin, Arch. Histol Jap. 48: 411-419.

Jindo, Y. Wine, R. N. Li Hong, L. And Chapin, R. E. 2001.Protein Kinase Activity Is Central to Rat Germ Cell Apoptosis Induced by Methoxyacetic Acid. Toxic Path, 29: 607-616.

Johanson, G., 2000. Toxycity Review Of Ethylene Glycol Monomethyl Ether and Its Acetate Ester. Critical Rev In Toxic, 30(3) : 307-345.

Ketti KT, Donald BS, Stedman BB, Welch F. 1996. Effects of 2-methoxyethanol on mouse neurulation. Teratology, 54: 219-229.

Ko, J., Humbert, S., Bronson, R. T., Takahashi, S., Ashok, B., Kulkarni, En Li, dan Tsai, Li-Huei, p35 and p39 are Essential for Cyclin-Dependent Kinase 5 Function During Neurodevelopment, 2001, J. Of Neurosci, Vol. 2 : 6758- 6771.

Lois, C., Garcia-verdugo, J-M., Alvarez-Buylla, A., 1996, Chain Migration of Neuronal Precursors, Science, Vol. 271.

Mc Call, M. A., Gregg, R. G., Behringer, R. R., Delaney, C. L., Galbreath, E. J., Zhang, C.L., Pearce, R. A., Chiu, S. Y., dan Messing, A., 1996, Proc. Natl.

Acad, 93: 6361-6366.

Miller RR., Hermann E.A., Langvardt PW., McKenna .J and Schwetz B.A., 1983.

Comparative Metabolism and Disposition of Ethylene Glycol Monomethyl Ether and Propylen Glycol Monomethyl Ether in Male Rats. Toxic and App Pharmac, 67: 229-237.

Mebus, C. A., and Welsch, F. 1989. The possible role of one-carbon moieties

in 2-methoxyethanol and 2-methoxyacetic acid induced development toxicity.

Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 98–109.

Moslen MT., Kaphalia L., Balasubramanian H., Yin Y.-M., William WA, 1995.

Species differences in testicular and hepatic biotransformation of 2- methoxyethanol. Toxicol, 96: 217-224.

Ohshima, T., Hirasawa, M., Tabata, H., Mutoh, T., Adhachi, T., Suzuki, t., Saruta, K., Iwasato, T., Itohara, S., Hashimoto, M., Nakajima, K., Ogawa, M., Kulkarni, A. B., dan Mikoshiba, K. 2007, CDK5 is Required forMultipolar-to- bipolar Transition During Radial Neuronal Migration and Proper Dendrite Development of Pyramidal Neurons in The Cerebral coretx, Develoment, Vo.

134: 2273-2284.

vi

Oudega, M. Dan Marani, E., Expression of Vimentin and Glial Fibrillary Acidic Protein in the Developing Rat Spinal Cord: an Immunocytochemical Study of the The Spinal Cord Glial Sytem, 1991, J.Anat, 179: 97-114.

Pekny, M., Clas B.,Johansson, Eliasson, C., Stakeberg, J., Wallén, Å.,

Perlmann, T Lendahl, U., Betsholtz, C., HenricBerthold, C., and Frisén, J., 1999, Abnormal Reaction to Central nervousSystem Injury in Mice Lacking Glial Fibrillary Acidic Protein and Vimentin, J. Cell Biol, Vol. 145, p. 503- 514.

Prihiyantoro E. Darmanto, W. Pidada, I.B., Soepriandono, H., 2004, Gangguan Migrasi dan Perkembangan Sel Saraf Pada Cerebrum dan Cerebelum Mencit Akibat Induksi 2-Methoxyethanol; Sebagai Model Mekanisme Kelainan Otak.

Laporan Penelitian Hibah Bersaing X/3.

Riederer, B. M., 1992, Differential Phosphorylation of Some Proteins of The Neuronal Cytoskeleton During Brain Development, Histochem J, 24: 783- 790.

Rugh, R., 1968. The Mouse : Its Reproduction and Development. Burgess Publishing Company, Minneapolis.

Ruyani, A. 2003. Teratogenesitas asam metoksiasetat pada tunas anggota tubuh depan mencit swiss webster; suatu pendekatan analisis protein. Desertasi Institut Teknologi Bandung.

Ruyani, A., et al., 2001. Perubahan Profil Protein Tunas Anggota Tubuh Depan Mencit (Mus musculus) Swiss Webster Akibat Perlakuan dengan Asam Metoksiasetat (MAA). Medika. 27: 363-367.

Scott, W.J., Fradkin, R., Wittfoht, W., and Nau, H., 1989. Teratologic

Potential of 2-Metoxyethanol and Transplacental Distribution of its Metabolite, 2-Methoxyacetic Acid, in Non-Human Primates. Teratology, 39:

363-373.

Schoenwolf, G. and J.L. Smith. 1990. Mechanisms of Neurulation. Traditional Viewpoint and Recent Advances. Development. 109:243-270.

Steel, R. G. D. dan Torie, J. H. 1981. Principles and procedures of statistics a biometrical approach. Mc Graw Hill Book Co. Singapore. p. 86-111, 137- 144.

Storer, T. I., and Usinger, R. L., 1957. General Zoology. Thirth Edition. Mac Grow- Hill Company, Inc. USA

Sun, X-Z., Takahashi, S., Cui, C., Zhang, R., Koga, K., Inouye, M., and Murata, Y., neuronal Migration and neuronal Migration Disorder in Cerebral Cortex, 1996, Enviromental Medicine, 46: 7-15.

Umansky, S. R. (1996). Apoptosis: molecular and cellular mechanisms (areview). Mol. Biol. 30, 285–295.

vi

Thyagarajan, A., and , Szaro, B. G. 2007, Dynamic endogenous association of Neurofilament mRNA with K-homology domain ribonucleoproteins in developing cerebral cortex, Brain Res, 1189: 33 – 42

Van Der Put, M. J. Nathalie., Van Strateen, W.M., Henny., Frans J.M. Trijbell. and H. J. Blom., 2001. Minireview Folate, Homocysteine and Neural Tube Defects:An Overview. Exp Biological Med Vol. 226(4):243–270.

Wilhelmsson, U,, Li, Z., Pekna, M., Berthold, C,H.,2 Blom, S., Eliasson, C.,

Renner, O., Bushong, E., Ellisman, M., Morgan ,T, E., and Pekny ,M., 2004, Absence of Glial Fibrillary Acidic Protein and Vimentin Prevents Hypertrophy of Astrocytic Processes and Improves Post-Traumatic Regeneration, J. Neurosci. Search, 24(21):5016-5021.

Wine, R.N., Ku, W.W., Li, L.H. and Chapin, R.E. 1997. Cyclophilin is a present in rat germ cells and is associated with spermatocyte apoptosis. Biol Reprod, 56: 493 – 446.

vi

LEMBAR PENGESAHAN

Ketua : Dra. Nurhaida Hafni Lubis, M.Pd.

Tim : Dra. Yulia Irnidayanti, M.Si.

Mengetahui

a.n. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Negeri Jakarta

Kapus SDM Jakarta, November 2010

Ketua Peneliti

Dr. Supriyadi, M.Pd Dra. N.H. Hafni Lubis, M. Pd.

NIP. 19480304 1975 021 2001 NIP. 1965 0765 2001 12 2001

vi

ABSTRACT

Hafni, N. H., dan Irnidayanti, Y., Ekspresi Protein dan mRNA glial fibrillary acidic protein (GFAP) Cerebrum Mencit Mus musculus (Swiss webster) uk-14 hari akibat induksi 2-Methoxyethanol

The present study was performed to obsevere the effect of 2-methoxyethanol (2-ME) on the expression cDNA Glial Fibriler Acidic Protein of brain embrio at intraperitonealy gestation days 14 (GD-14). 2-ME was dissolved in aquadest steril and was given with a dose of 7,5 mmol/kg body weight on gestation days 10. The control pregnant mice were given aquadest steril only. The result that administration of 2-ME on days 10 of gestation were not expression both of GFAP cDNA on control and treatment embryonic days 14. GFAP was not expressed on brain embrionic at GD-14 because this protein will be expressed at postnatal 3 days. The GFAP is protein particularly useful as a markers of glial differentiation. Glial cells play role an important in the developing nervous system. On the other hand, glial cells at GD- 14, were not differentiation, and still in mitosis phase.

Keyword:GFAP, 2-Methoxyethanol, brain, black-6 mice