3. METODOLOGI PENELITIAN
3.2 Metode penelitian
Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama penelitian adalah identifikasi bakteri. Tahap kedua adalah penelitian yang bertujuan untuk mencari suhu, pH, cahaya dan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen. Tahap ketiga adalah penelitian yang bertujuan untuk mengetahui pengaruh sumber karbon dan sumber nitrogen terhadap pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen.
25 Selain itu, sebelum penelitian dimulai dilakukan pembuatan media untuk stok bakteri dan penyegaran bakteri yang digunakan dalam proses fermentasi, dengan langkah-langkah sebagai berikut :
(a) Pembuatan media padat
Pembuatan media dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml dengan volume medium 250 ml. Komposisi media padat terdiri dari pepton 5 g, ekstrak khamir 2 g, NaCl 20 g, dan agar 20 g. Semua bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades, pH medium diatur pada 7. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o
(b) Penyegaran bakteri
C selama 15 menit. Setelah itu media dituang ke dalam cawan petri, masing-masing sebanyak 20 ml secara aseptik. Setelah media dingin dan padat, siap digunakan untuk penyegaran bakteri.
Bakteri digoreskan pada media padat secara aseptik. Setelah itu bakteri diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 30oC selama 24 jam.
3.2.1 Penelitian tahap petama: Identifikasi bakteri
Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan morfologi dan ciri-ciri fisiologi bakteri.
1). Morfologi
(1). Pewarnaan Gram
Bakteri dioles di atas gelas obyek sebanyak satu lup dan diratakan dengan aquades secukupnya hingga ukuran 1 x 1 cm, kemudian difiksasi di atas api hingga kering. Tetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit. Dicuci dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit. Bilas dengan aquades, kemudian dibilas lagi dengan campuran etanol 95% sebanyak 80 ml dan aseton 20 ml, selama 1 menit. Dibilas kembali dengan aquades, kemudian diwarnai dengan safranin selama 1 menit. Selanjutnya dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Preparat siap diamati dengan mikroskop; bila berwarna violet gelap berarti termasuk dalam bakteri Gram-positif, bila berwarna oranye maka termasuk dalam bakteri Gram-negatif.
26 (2). Pemeriksaan mikroskop
Preparat yang sudah disiapkan pada pewarnaan Gram selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa obyektif minyak imersi. Dengan pengamatan mikroskopik dapat diketahui bentuk sel bakteri bulat (kokus) atau batang (basili).
(3). Pergerakan bakteri
Medium yang digunakan dalam uji pergerakan bakteri adalah medium motilitas. Secara aseptis dengan menggunakan loop, suspense bakteri ditusukkan ke dalam medium motilitas yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35 oC selama 48 jam. Bila pertumbuhan bakteri menyebar, maka bakteri tersebut bergerak (motil), dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak.
2) Ciri-ciri Fisiologi
(1). Uji Katalase
Secara aseptis diambil satu lup pertumbuhan bakteri dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian ditetesi dengan satu tetes larutan 30% H2O2. Adanya enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun.
(2). Uji Oksidase
Kultur bakteri ditumbuhkan pada medium Trypticase Soy Agar (TSA), kemudian koloni yang terbentuk ditetesi dengan pereaksi untuk uji oksidase yaitu p-aminodimetilanilin oksalat 1% sekitar dua sampai tiga tetes. Uji positif ditandai dengan perubahan koloni menjadi merah muda, kemudian merah tua, dan akhirnya hitam.
(3). Uji Indol
Medium yang digunakan adalah medium Tryptone Broth. Bakteri yang diuji diionokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi Trypton Broth, dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Setelah inkubasi, masing-masing tabung
27 ditambahkan 0,5 ml pereaksi Kovaks. Terbentuknya cincin warna merah pada permukaan medium menunjukkan uji Indol positif.
(4). Uji H2
Medium yang digunakan pada uji H S
2S adalah medium Sulfit Agar. Bakteri yang akan diuji diinokulasi dengan cara menusuk loop pada medium tegak Sulfit Agar yang sudah disiapkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 35oC selama 48 jam. Terbentuknya warna hitam menunjukkan uji H2S positif.
(5). Uji Reduksi Nitrat
Bakteri diinokulasi ke dalam Nitrat Broth kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 jam hingga 48 jam. Kemudian tambahkan larutan α Naftilamin dan larutan asam sulfanilat masing-masing sebanyak 1 ml. Hasil uji positif bila terbentuk warna merah. Hasil uji negatif, bila tidak terjadi perubahan warna dan pengujian dilanjutkan dengan menambahkan serbuk Zink. Bila tidak terjadi perubahan warna maka hasil pengujian positif,nitrat direduksi menjadi nitrit. Bila terjadi perubahan warna menjadi merah maka hasil pengujian negatif, maka bakteri tidak mereduksi nitrat.
(6). Uji Fermentasi Karbohidrat
Medium yang digunakan pada pengujian ini adalah Glukosa Broth, Laktosa Broth, Fruktosa Broth, dan Sukrosa Broth. Masing-masing medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan menambahkan Brom Creso Purple (BCP) dan tabung Durham.
Bakteri yang akan diuji secara aseptis diinokilasikan pada masing-masing medium yang telah disiapkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 30oC selama 48 jam. Uji fermentasi positif ditandai dengan terbentuknya asam yaitu terjadi perubahan warna menjadi kuning, dan bila bakteri tersebut memproduksi gas akan ditandai dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham (Fardiaz, 1992).
3.2.2 Penelitian tahap kedua
Penelitian tahap kedua adalah penetapan suhu, pH, cahaya dan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen.
28 1) Penetapan suhu optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan
pigmen
Suhu air laut berkisar antara 25oC sampai 32oC dengan kisaran kurang dari 2oC (Austin, 1988). Pada penelitian ini digunakan suhu inkubasi yang sesuai dengan suhu air laut yaitu 25oC, 30oC dan 35oC.
(1). Persiapan medium cair
Komposisi medium cair yang digunakan terdiri dari pepton 5 g, ekstrak khamir 2 g, trace element 5 ml, dan NaCl 20 g. Semua bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades, kemudian dituang ke dalam 3 labu erlenmeyer 500 ml masing- masing sebanyak 250 ml. pH awal medium diatur pada 7. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
(2). Percobaan suhu bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen. a. Proses produksi pigmen
Proses produksi pigmen dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml yang telah diisi 250 ml medium cair. Bakteri yang telah disegarkan dalam medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian bakteri diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi untuk percobaan diatur pada 25oC, 30oC dan 35o
b. Isolasi pigmen
C. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.
Sampel yang menghasilkan pigmen kemudian disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan pigmen ekstraseluler. Biomassa yang diperoleh diekstrak dengan metanol untuk mendapatkan pigmen (intraseluser) dengan cara mensentrifus pigmen pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.
c. Pengukuran konsentrasi pigmen
Filtrat yang diperoleh merupakan pigmen yang dihasilkan. Selanjutnya dengan menggunakan spektrofotometer, dilakukan scanning untuk mengetahui serapan maksimum bagi pigmen intraseluler maupun pigmen ekstraseluler.
29 Konsentrasi pigmen kemudian diukur pada panjang gelombang sesuai dengan hasil scanning yang diperoleh.
2) Penetapan pH optimum bagi pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen
Nilai pH air laut berkisar antara 7,5 dan 8,5 (Austin, 1988). Nilai pH yang dicoba pada percobaan ini adalah 5, 7, dan 9. Nilai pH 5 juga dicoba pada penelitian ini untuk mempelajari adanya kemungkinan bakteri laut yang digunakan mengeluarkan metabolit sekunder pada pH yang ekstrim.
(1). Persiapan medium cair
Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk penentuan suhu optimum, tetapi medium diatur pada pH 5, 7 dan 9. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi, pH medium cair kembali diperiksa. Apabila nilai pH berubah, nilai pH dikembalikan sesuai dengan pH semula dengan menambahkan NaOH atau HCl steril.
(2). Percobaan pH optimum bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen
a. Proses produksi pigmen
Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen yang optimum pada percobaan (1). Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.
b. Isolasi pigmen
Sama dengan isolasi pigmen pada penentuan suhu optimum. c. Pengukuran konsentrasi pigmen
Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum.
30 3) Penetapan cahaya optimum bagi pertumbuhan sel bakteri laut dan
pembentukan pigmen
Intensitas cahaya yang digunakan pada penelitian ini adalah 2350 Wm-2 (kondisi lab tanpa penambahan cahaya dari lampu), 4700 Wm-2, dan 12500 Wm-2. Intensitas cahaya diperoleh dengan cara mengatur jarak letak sampel pada inkubator goyang dengan lampu Philips 10 Watt dan 40 Watt.
(1). Persiapan medium cair
Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk penentuan suhu dan pH optimum. pH medium diatur sesuai dengan pH yang memberikan pertumbuhan yang terbaik dari percobaan (2). Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
(2). Percobaan cahaya bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen a. Proses produksi pigmen
Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan yang optimum. Intensitas cahaya yang digunakan 2350 Wm-2, 4700 Wm-2, dan 12500 Wm-2
b. Isolasi pigmen
. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.
Sama dengan isolasi pigmen pada penentuan suhu dan pH optimum. c. Pengukuran konsentrasi pigmen
Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum.
4). Penetapan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri laut dan pembentukan pigmen
Salinitas air laut berkisar antara 32 permil dan 38 permil, sedangkan pada perairan pantai lebih rendah yaitu antara 10 permil dan 32 permil. Salinitas air laut tertinggi pada Laut Merah yaitu 44 permil. Berdasarkan kisaran tersebut, salinitas
31 yang digunakan pada penelitian ini adalah 0 permil, 10 permil, 20 permil, 30 permil, dan 40 permil.
(1). Persiapan medium cair
Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk penentuan suhu dan pH optimum, salinitas diatur pada 0 permil, 10 permil, 20 permil, 30 permil, dan 40 permil, sedangkan pH diatur sesuai dengan pH yang 01+memberikan pertumbuhan yang terbaik dari percobaan (2). Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
(2). Percobaan salinitas bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen a. Proses produksi pigmen
Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan yang optimum. Intensitas cahaya yang digunakan adalah intensitas cahaya yang menghasilkan pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen yang optimum berdasarkan hasil percobaan (3). Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam.
b. Isolasi pigmen
Sama dengan isolasi pigmen seperti sebelumnya. c. Pengukuran konsentrasi pigmen
Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum.
3.2.3 Penelitian tahap ketiga
Penelitian tahap ketiga adalah penetapan jenis sumber karbon dan sumber nitrogen yang optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen.
1). Penetapan sumber karbon optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen
Sumber karbon yang digunakan dalam percobaan adalah glukosa, asetat, sitrat dan maltosa.
32 (1). Persiapan medium cair
Komposisi medium cair untuk percobaan yang menggunakan sumber karbon glukosa, asetat, sitrat dan maltosa disajikan pada Tabel 6. Medium untuk masing- masing percobaan setelah ditimbang dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 500 ml dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 250 ml, kemudian pH medium diatur hingga mencapai pH optimum pada percobaan tahap pertama dengan menambahkan NaOH atau HCl. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. pH medium yang telah steril diperiksa kembali, apabila pH medium berubah dilakukan penambahan NaOH atau HCl sampai pH medium pH optimum.
Tabel 6 Komposisi medium cair yang digunakan pada percobaan sumber karbon
Sumber Karbon Komposisi Medium Satuan
Media Kompleks (Kontrol)
Pepton 5 Ekstrak Khamir 2
Trace Element 5
NaCl konsentrasi optimum
g/l g/l g/l g/l Glukosa Glukosa 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5
NaCl konsentrasi optimum
g/l g/l ml/l g/l Asetat Asetat 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5
NaCl konsentrasi optimum
g/l g/l ml/l g/l Sitrat Sitrat 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5
NaCl konsentrasi optimum
g/l g/l ml/l g/l Maltosa Maltosa 5 Ekstrak Khamir 2 Trace Element 5
NaCl konsentrasi optimum
g/l g/l ml/l g/l
(2). Percobaan sumber karbon bagi pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen a. Proses produksi pigmen
Proses produksi pigmen dilakukan dalam erlenmeyer 500 ml yang telah berisi 250 ml medium cair yang telah disiapkan pada persiapan (a). Bakteri yang telah disegarkan dalam medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan
33 kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu optimum pada penelitian tahap pertama. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120 dan 144 jam.
b. Isolasi pigmen
Sama dengan isolasi pigmen pada penelitian tahap pertama. c. Pengukuran konsentrasi pigmen
Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum.
2). Penetapan sumber nitrogen optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen
Sumber nitrogen yang digunakan dalam percobaan adalah pepton, ekstrak khamir, NaNO3, dan (NH4)2SO4.
(1). Persiapan medium cair
Komposisi medium cair untuk percobaan yang menggunakan sumber nitrogen pepton, ekstrak khamir, NaNO3, dan (NH4)2SO4 disajikan pada Tabel 7. Sumber Karbon yang digunakan dalam percobaan ini adalah sumber karbon yang memberi hasil optimum dalam pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen pada percobaan pertama. Selain itu digunakan juga NaCl yang memberikan hasil yang optimum dalam pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen dari percobaan tahap pertama serta trace element. Medium untuk masing-masing percobaan setelah ditimbang dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 500 ml dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 250 ml, kemudian pH medium diatur hingga mencapai pH optimum pada percobaan tahap pertama dengan menambahkan NaOH atau HCl. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. pH medium yang telah steril diperiksa kembali, apabila pH medium berubah dilakukan penambahan NaOH atau HCl sampai pH medium pH optimum.
(2). Percobaan sumber nitrogen bagi pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen
34 Proses produksi pigmen dilakukan dalam erlenmeyer 500 ml yang telah berisi 250 ml medium cair yang telah disiapkan pada persiapan (a). Bakteri yang telah disegarkan dalam medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu optimum pada penelitian tahap pertama. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120 dan 144 jam.
b. Isolasi pigmen
Sama dengan isolasi pigmen pada penelitian tahap pertama. c. Pengukuran konsentrasi pigmen
Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum.
Tabel 7 Komposisi medium cair yang digunakan pada percobaan sumber nitrogen
Sumber Nitrogen Komposisi Medium Satuan
Pepton Pepton 5 Sumber Karbon optimum 5
Trace Element 5
NaCl konsentrasi maksimum g/l g/l ml/l g/l
Ekstrak Khamir Ekstrak Khamir 5 Sumber Karbon optimum 5
Trace Element 5
NaCl konsentrasi maksimum g/l g/l ml/l g/l
NaNO3 NaNO3
Sumber Karbon optimum 5 5
Trace Element 5
NaCl konsentrasi maksimum g/l g/l ml/l g/l
(NH4)2SO4 (NH4)2SO4
Sumber Karbon optimum 5 5
Trace Element 5
NaCl konsentrasi maksimum g/l g/l ml/l g/l
3.2.4 Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan pada setiap pengambilan contoh adalah :
1. Konsentrasi sel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm dan berat kering sel.
2. Konsentrasi pigmen diukur dengan spektrofotometer. 3. Perubahan pH diukur dengan kertas pH.
35 4. Laju spesifik pertumbuhan sel (µ), laju spesifik pembentukan pigmen (qp).
3.2.5 Rancangan percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (Koopmans, 1987).
3.2.6 Analisis data
Pengaruh suhu, pH, cahaya dan salinitas, sumber karbon dan sumber nitrogen terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen dianalisis dengan Analisis Ragam. Jika terdapat perbedaan akibat perlakuan suhu (25oC, 30oC dan 35oC), pH (5, 7 dan 9), cahaya (2350 Wm-2, 4700 Wm-2 dan 12500 Wm-2) dan salinitas (0 permil, 10 permil, 20 permil, 30 permil dan 40 permil), sumber karbon (media kompleks, glukosa, asetat, sitrat dan maltosa) dan sumber nitrogen (pepton, ekstrak khamir, (NH4)2SO4 dan NaNO3) terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen, maka pengujian dilanjutkan dengan menggunakan metode BNT (Koopmans, 1987).
3.2.7 Tempat dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Kimia dan Biokimia Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB.
Kegiatan penelitian dilakukan mulai dari bulan Oktober 1998 sampai dengan bulan Oktober 1999.
36