3. METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri dan pembentukan
4.1 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen
Hasil identifikasi dari sampel bakteri yang diuji diduga kuat adalah Mesophilobacter sp. (Lampiran 1). Hasil pengukuran konsentrasi sel bakteri dan pigmen dengan menggunakan media marine broth (ekstrak khamir, pepton, NaCl dan trace element) pada suhu 25oC, 30oC dan 35oC dengan pH 7 dapat dilihat pada Lampiran 2. Kurva pertumbuhan sel bakteri dan pigmen pada suhu 25oC, 30oC dan 35oC disajikan pada Gambar 3. Dari Gambar 3 dapat dilihat bahwa pertumbuhan sel bakteri pada percobaan ini mengalami beberapa fase seperti yang dinyatakan oleh Middlebeek et al. (1992a), yaitu fase adaptasi, fase logaritmik, fase stasioner dan akhirnya mengalami fase kematian.
Keterangan : s: sel bakteri p: pigmen
Gambar 3 Kurva pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen oleh Mesophilobacter sp. pada suhu kultivasi 25oC, 30oC, dan 35oC dengan pH 7. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 Ko n sen tr asi S el (O D 540 n m ) d an Ko n sen tr asi P ig m en ( O D 463 n m )
Waktu Kultivasi (jam)
25oC, pH 7s 30oC, pH 7s 35oC, pH 7s
37 Bakteri yang diikultivasi pada suhu 30oC dan 35oC segera menunjukkan peningkatan sel (pertumbuhan) pada masa inkubasi 3 jam, sedangkan bakteri yang dikultivasi pada suhu 25oC mengalami peningkatan sel setelah 9 jam inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa medium pertumbuhan pada pH 7 dengan suhu 30oC dan 35oC merupakan lingkungan yang sesuai bagi Mesophilobacter sp. untuk bertumbuh dan memperbanyak sel.
Masa adaptasi yang panjang dapat merugikan suatu proses produksi, terutama produk yang merupakan hasil metabolit sekunder seperti pigmen. Pigmen merupakan hasil metabolit sekunder yang pada umumnya dihasilkan atau dibentuk setelah fase logaritmik berakhir (Sa’id, 1987). Namun ada juga beberapa dari metabolit sekunder yang dibentuk bersamaan dengan fase logaritmik. Variasi terbentuknya metabolit sekunder ini menurut Bu’Lock et al., 1975 in Vining, 1986 dipengaruhi juga oleh nutrien yang digunakan dalam medium pertumbuhan, terutama dalam kultur tertutup. Pigmen yang dihasilkan pada percobaan ini adalah pigmen warna orange yang mempunyai absorban maksimum pada λ 463 nm.
Secara deskriptif, berdasarkan hasil pengamatan kecepatan bakteri memasuki setiap fase pertumbuhan terlihat bahwa 30oC merupakan suhu inkubasi yang paling baik dibanding dengan suhu 25oC dan 35oC. Pada suhu 30oC dan 35oC, sel bakteri segera tumbuh dan memperbanyak sel hingga memasuki fase stasioner masing-masing setelah 24 jam dan 48 jam. Pada suhu 25oC bakteri memerlukan masa adaptasi yang panjang sebelum tumbuh, yaitu 9 jam. Setelah itu baru memasuki fase logaritmik hingga 30 jam inkubasi. Fase stasioner dimasuki setelah 48 jam inkubasi.
Laju pertumbuhan sel spesifik (µ) yang diperoleh selama bakteri berada pada fase logaritmik, pada suhu 25oC, 30oC dan 35oC secara berturut-turut adalah 0,19; 0,24 dan 0,06 jam-1. Nilai µ merupakan slope dari persamaan garis regresi linier dari data konsentrasi sel (ln OD 540 nm) pada fase pertumbuhan eksponensial (Blanch dan Clark, 1994). Berdasarkan nilai µ sel dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diinkubasi pada suhu 30oC mempunyai laju pertumbuhan sel spesifik (µ) yang lebih tinggi dibanding dengan suhu 25oC dan 35o
Laju pembentukan pigmen spesifik (qp) pada suhu 25
C. o
C, 30oC dan 35oC secara berturut-turut adalah 0,01; 0,02 dan 0,003 jam-1. Nilai qp adalah merupakan
38 perbandingan antara konsentrasi pigmen dengan konsentrasi sel dan dikali dengan laju spesifik pertumbuhan sel (Blanch dan Clark, 1994). Berdasarkan nilai qp
dapat disimpulkan juga bahwa bakteri yang diinkubasi pada suhu 30oC mempunyai laju pertumbuhan pigmen spesifik (qp) yang lebih tinggi dibanding
dengan suhu 25oC dan 35oC. Contoh perhitungan µ dan qp disajikan pada
Lampiran 3.
Rata-rata konsentrasi sel dan pigmen serta nilai µ dan qp hasil percobaan ini
disajikan secara ringkas pada Tabel 8. Dari Tabel 8 dapat dilihat bahwa rata-rata
konsentrasi sel tertinggi adalah hasil inkubasi pada suhu 25oC sebesar 3,51 + 0,55 (g/l). Rata-rata konsentrasi pigmen yang diperoleh dari hasil pengukuran OD 463 nm adalah sama untuk suhu 25oC dan 30oC yaitu 0,12. Akan tetapi nilai µ dan qp terbesar adalah pada suhu 30oC, yaitu sebesar 0,24 dan
0,02 jam-1
T (
.
Tabel 8 Hasil pengukuran beberapa variabel dari kultivasi Mesophilobacter sp. dalam media marine broth pada pH 7, suhu kultivasi berbeda
o µ (jam C) -1 qp (jam ) -1 X (OD 540 nm ) ) BK (g/l) Pintraseluler (OD 463 nm) 25 30 35 0,19 0,24 0,06 0,01 0,02 0,003 1,61 + 0,32 a 1,37 + 0,11 a 1,55 + 0,20 3,51 + 0,55 2,83 + 0,16 3,17 + 0,34 a 0,12 + 0,02 a 0,12 + 0,003 a 0,08 + 0,002 b
Keterangan : Nilai dengan superskrip (a, b) yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata. T, suhu inkubasi; µ, laju spesifik pertumbuhan sel; qp, laju spesifik pembentukan pigmen; X, rata-rata konsentrasi sel pada fase stasioner; BK, berat kering biomassa; P, rata-rata konsentrasi pigmen pada fase stasioner.
Hasil di atas menunjukkan bahwa suhu medium pertumbuhan merupakan faktor yang penting dalam pembentukan pigmen. Dari hasil analisis dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dapat disimpulkan bakteri Mesophilobacter sp. dapat tumbuh dengan baik dan tidak berbeda nyata pada ketiga suhu yang dicobakan pada selang kepercayaan 95%. Analisis konsentrasi pigmen yang dihasilkan pada ketiga suhu percobaan dengan RAL, terbukti bahwa pigmen yang dihasilkan pada suhu kultivasi 30oC adalah sama dan tidak berbeda
39 nyata pada selang kepercayaan 95% dengan suhu 25oC. Hasil perhitungan statistika disajikan pada Lampiran 4.
Fang dan Cheng (1993) dalam penelitiannya mendapati bahwa suhu yang optimum dalam pertumbuhan massa sel Phaffia rhodozyma adalah 15°C – 20°C, tetapi suhu optimum dalam pembentukan pigmen astaxanthin adalah 15oC. Sementara itu Lin (1973) in Lin dan Demain (1991), serta Lin dan Demain (1991) mendapati bahwa pertumbuhan yang optimum untuk Monascus sp. adalah suhu 37°C, dilain pihak Yoshimura et al. (1975) menyatakan bahwa Monascus sp. dari strain yang lain lebih menyukai suhu yang lebih rendah, yaitu 25°C. Johnson dan Lewis (1979), melaporkan bahwa suhu optimum bagi pertumbuhan dan pembentukan pigmen dari P. rhodozyma adalah antara 20oC sampai 22oC.
Pada ketiga suhu inkubasi terlihat bahwa pigmen terbentuk bersamaan dengan pertumbuhan sel, walaupun dengan konsentrasi yang rendah yaitu 0,016 pada OD 463 nm. Kondisi ini memperjelas bahwa pigmen yang dihasilkan oleh Mesophilobacter sp. pada medium pertumbuhan ini merupakan produk dari metabolit sekunder yang pembentukannya berasosiasi dengan pertumbuhannya (growth associated).
Berdasarkan hasil analisis yang telah dilakukan dengan menggunakan RAL ternyata pigmen yang dihasilkan pada suhu kultivasi 30oC adalah sama dan tidak berbeda nyata pada selang kepercayaan 95% dengan suhu 25oC, akan tetapi nilai laju pertumbuhan spesifik terhadap pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen pada suhu 30o C lebih tinggi dibanding suhu 25oC. Suhu 30oC kemudian dijadikan sebagai suhu yang optimum dan digunakan sebagai suhu kultivasi dalam percobaan berikutnya.