Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2014-Agustus 2015. Sampel tanah diambil dari tiga lokasi lahan (Gambar 2) yaitu lahan bekas tambang timah di Batu Ampar, Bangka Belitung, lahan bekas tambang emas di Pongkor, Bogor, Jawa Barat dan lahan pertanian di Cikabayan, Bogor, Jawa Barat (Tabel 1). Isolasi dan seleksi MPK dilakukan di laboratorium Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumber Daya Lahan (DITSL), Institut Pertanian Bogor (IPB). Analisa kimia dilakukan di laboratorium Kimia dan Kesuburan Tanah, DITSL. Analisa molekuler dilakukan di Institut Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC), Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Gambar 2 Lokasi pengambilan sampel tanah (Google Maps 2014) Batu Ampar
Pongkor
9
Tabel 1 Lokasi, jenis vegetasi dan koordinat pengambilan sampel tanah
Lokasi Jenis Vegetasi Koordinat
Lahan Pertanian, Cikabayan
Kakao (Theobroma cacao L.) S 06033.144’ ; E 106043.069’
Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) S 06033.106’ ; E 106043.008’
Kopi (Coffea arabica L.) S 06033.105’ ; E 106042.977’
Lahan bekas tambang timah, Bangka
Karamunting (Melastoma malabathricum L.) S 01059.376' ; E 106008.579’
Akasia (Acacia mangium Willd.) S 01059.401’ ; E 106008.589’
Simpur (Dillenia suffruticosa (Griff) Martelli) S 01059.393’ ; E 106008.389’
Lahan bekas tambang emas, Pongkor
Sonobrit (Dalbergia latifolia Roxb.) S 06038.692’ ; E 106034.233’
Ganitri (Elaeocarpus serratus L.) S 06038.627’ ; E 106034.219’
Puspa (Schima wallichii (DC.) Korth.) S 06038.745’ ; E 106034.256’
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan sampel tanah adalah bor tanah dan cangkul, sedangkan penentuan koordinat lokasi pengambilan sampel tanah digunakan alat berupa Global Positioning System (GPS). Isolasi, seleksi dan pengujian MPK digunakan alat berupa autoclave, laminar air flow dan
micropipet. Perlengkapan uji ke tanaman sorgum terdiri dari cangkul dan pipa paralon ukuran ¾ inch. Peralatan analisa kimia terdiri dari spekrofotometer UV-Vis (Varian-Cary 300) dan Flamefotometer (Corning 405). Perlengkapan identifikasi molekuler terdiri dari UV transilluminator, Polymerase Chain
Reaction (PCR) dan perangkat elektroforesis.
Bahan untuk isolasi, seleksi dan pengujian MPK terdiri dari sampel tanah dari tanah pasca tambang timah, tanah pasca tambang emas, tanah pertanian, media Alexsandrov, media blood agar, media NA (Nutrient Agar), media
pikovskaya, bibit tembakau varietas Havana, benih padi varietas Ciherang dan pereaksi molibdat. Sumber kalium yang digunakan adalah feldspar dari 2 lokasi yaitu feldspar asal Gunung Kuda, Cirebon, Jawa Barat dengan kadar K2O 1.93 % dan feldspar asal Malang, Jawa timur dengan kadar K2O 1.74 %. Sumber fosfat yang digunakan adalah Ca3(PO4)2 dengan kadar kadar P2O5 45.76 % dan batuan fosfat asal Blitar, Jawa Timur dengan kadar kadar P2O5 26.61 %. Sebelum digunakan, feldspar dan batuan fosfat terlebih dahulu digerus lalu disaring dengan ukuran saringan 270 mesh. Bahan untuk uji ke tanaman sorgum terdiri dari benih sorgum varietas Numbu, pupuk Urea (46.72 % N) dan pupuk SP-36 (33.59 % P2O5), air minim hara (51.12 ppm C-organik, 14.06 ppm N total, 0.23 ppm P total dan 0.12 ppm K total) dan media tanah dari lahan pertanian Cikabayan, Bogor, Jawa Barat (1.23 % C-organik, 0.13 % N total, 144 ppm P total, 23.08 ppm P tersedia, 140 ppm K total dan 26.58 ppm K tersedia). Bahan yang digunakan untuk identifikasi molekuler terdiri dari larutan penyangga, proteinase-K, agarosa, Etidium Bromida (EtBr), dNTP dan taq DNA polymerase.
Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel Tanah
Pengambilan sampel tanah dilakukan di daerah sekitar perakaran tanaman pada 3 jenis tanaman yang berbeda pada tiap-tiap lokasi pengambilan sampel
10
tanah dengan 3 ulangan. Pengambilan sampel tanah dilakukan dengan membagi daerah pengambilan sampel menjadi 4 titik (Gambar 3). Pengambilan sampel tanah menggunakan cangkul atau linggis dengan cara menggali tanah sampai kedalaman 0 sampai 20 cm, tanah yang telah digali dilihat lapisan tanah yang ada, kemudian pada lapisan yang terlihat sama, sampel tanah diambil menggunakan sendok semen, lalu dikompositkan. Tanah diambil 100 g untuk isolasi mikrob dan 250 g untuk analisis fisik dan kimia tanah.
Keterangan : = Tanaman = Titik Sampling
Gambar 3 Denah pengambilan contoh tanah
Isolasi Mikrob Pelarut Kalium
Isolasi MPK memodifikasi metode dari Prajapati dan Modi (2012) menggunakan media Alexandrov (Tabel 2). Sampel tanah dikeringanginkan terlebih dahulu. Tahapan isolasi BPK dimulai dengan menginkubasi 10 g berat kering mutlak (BKM) tanah ke 90 ml media Alexandrov broth selama 4 hari. Sedangkan isolasi FPK dilakukan dengan menginkubasi 10 g BKM tanah ke 90 ml media Alexandrov broth yang telah ditambahkan kloramfenikol selama 7 hari. Sampel tanah yang telah diinkubasi diencerkan menggunakan metode pengenceran (dilution method) dengan mensuspensikan 1 ml media dari hasil inkubasi ke 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85 %) (10-1), langkah tersebut diulang sampai pengenceran 10-4 untuk bakteridan 10-3 untuk fungi (Gambar 4).
Isolasi mikrob menggunakan metode sebar (spread plate). Media
Alexandrovagar (bakteri) atau Alexandrovagar yang ditambahkan kloramfenikol
(fungi) dituang dan disebar ke seluruh permukaan cawan petri dan dibiarkan sampai mengeras. Sebanyak 0.1 ml hasil pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi media Alexandrov agar kemudian disebar ke seluruh permukaan media dan dinkubasi selama 4 sampai 7 hari.Perlakuan ini diulang sebanyak 2 ulangan. Prajapati et al. (2012) menyebutkan bahwa koloni yang tumbuh dan membentuk zona bening pada media merupakan koloni MPK.
Tabel 2 Komposisi media Alexandrov agar (Prajapati & Modi 2012)
Bahan Dosis (%) Glukosa 1 Yeast extract 0.5 MgSO4.7H2O 0.05 FeCl3 0.0005 CaCO3 0.01 CaPO4 0.2 Feldspar 0.5 Agar 2
11 10 g sampel tanah 1ml hasil inkobasi 1ml suspensi 10-1 1ml suspensi 10-2 1ml suspensi 10-3
Gambar 4 Metode pengenceran
Seleksi Patogenitas Mikrob Pelarut Kalium
Seleksi patogenitas terdiri dari uji hipersensitif dan uji hemolisis. Pengujian respon hipersensitif dilakukan untuk mengetahui potensi MPK sebagai patogen bagi tanaman. Pengujian respon hipersensitif pada BPK memodifikasi metode Schaad et al. (2001) yang dilakukan dengan membiakkan isolat bakteri pada media Nutrient broth (NB) dan diinkubasi selama 12 jam pada suhu ruang. Isolat pada media NB kemudian diambil menggunakan alat suntik (syringe) lalu disuntikkan sebanyak 0.1 ml (109 SPK/ml) ke daun tembakau (Nicotiana tabacum L.) varietas Havana. Penyuntikan isolat ke daun tembakau dilakukan tanpa menggunakan jarum suntik. Kontrol negatif dilakukan dengan menyuntikkan daun tembakau menggunakan aquadest steril dan kontrol positif dilakukan dengan menyuntikkan daun tembakau menggunakan Xantomonas sp. Pengamatan dilakukan dengan mengamati perubahan pada daun tembakau selama 72 jam, jika terjadi gejala nekrosis pada titik penyuntikan, maka BPK tersebut berpotensi sebagai patogen tanaman.
Pengujian respon hipersensitif pada FPK memodifikasi metode Mahmoud et al. (2013) yang dilakukan dengan membiakkan isolat fungi pada media Potato Dextrose Broth (PDB) sampai fungi menutupi seluruh permukaan media. Benih padi varietas Ciherang non-steril direndam selama 24 jam pada media PDB yang telah ditumbuhi FPK. Benih padi yang telah direndam kemudian disemai pada kapas steril yang telah dibasahi dengan aquadest. Penyemaian benih dilakukan sampai benih berumur 7 hari setelah semai (HSS), kelembaban kapas
Alexandrovbroth atau
Alexandrovbroth + kloramfenikol
4 atau 7 hari 9 ml NaCl 0.85% 9 ml NaCl 0.85% 10-1 10-2 9 ml NaCl 0.85% 10-3 9 ml NaCl 0.85% 10-4
12
terus dijaga dengan menyiram kapas secara rutin dengan aquadest. Sebagai kontrol negatif digunakanlah benih padi yang direndam dengan air steril dan kontrol positif digunakan benih padi yang direndam dengan fungi Rhizotocnia solani. Kriteria seleksi dilihat dari persentase tumbuh, jika persentase tumbuh benih yang direndam lebih rendah dari kontrol negatif (aquadest), maka fungi berpotensi sebagai patogen bagi tanaman. Mikrob yang teridentifikasi sebagai patogen bagi tanaman tidak digunakan dalam pengujian selanjutnya.
Pengujian hemolisis dilakukan untuk mengetahui potensi MPK sebagai patogen bagi manusia dan hewan. Uji hemolisis memodifikasi metode Difco (2009) dengan menumbuhkan MPK yang lulus dari uji hipersensitif pada media
Blood agar (Tabel 3) yang telah dicampur darah domba 5 % dari domba jenis Ekor Gemuk, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni menunjukkan bahwa koloni mikrob tersebut bersifat patogen bagi manusia dan hewan.
Tabel 3 Komposisi media Blood agar (Himedia 2013)
Bahan Dosis (%) Tripton 1.4 Pepton 0.45 Yeast extract 0.45 NaCl 0.5 Agar 2
Uji Indeks Pelarutan Kalium dan Fosfat
Pengujian indeks pelarutan kalium dilakukan untuk menentukan 10 MPK terbaik dari MPK yang lolos uji patogenitas. Pengujian dilakukan dengan membiakkan isolat yang lolos uji patogenitas ke media Alexandrov agar
kemudian dihitung indeks pelarutan kalium dari koloni MPK tersebut. Sumber kalium yang ditambahkan pada media Alexandrov adalah feldspar yang berasal dari Gunung Kuda, Cirebon, Jawa Barat dan feldspar yang berasal dari Jawa Timur. Sebanyak 10 isolat MPK yang memiliki indeks pelarutan kalium terbesar diambil untuk dilakukan pengujian selanjutnya yaitu uji indeks pelarutan fosfat dan uji kemampuan mikrob melarutkan sumber kalium dan fosfat di media cair.
Uji indeks pelarutan fosfat bertujuan untuk mengetahui kemampuan mikrob selain sebagai pelarut kalium, juga sebagai pelarut fosfat. Pengujian dilakukan dengan membiakkan 10 isolat mikrob pelarut kalium terbaik pada media Pikovskaya agar (Tabel 4) dengan sumber fosfat berupa Ca3(PO4)2 dan batuan fosfat asal Blitar, Jawa timur. Isolat yang membentuk zona bening pada media menunjukkan isolat dapat melarutkan fosfat. Rumus yang digunakan untuk mengukur indeks pelarutan fosfat sama dengan rumus pengukuran indeks pelarutan kalium (Edi et al. 1996). Rumus indeks pelarutan kalium dan fosfat adalah sebagai berikut,
Indeks Pelarutan Kalium/Fosfat = Diameter total (koloni + zona bening) Diameter koloni
13
Tabel 4 Komposisi media Pikovskaya (Himedia 2011)
Bahan Dosis (%) Yeast extract 0.05 Dekstrosa 1 Sumber fosfat 0.5 (NH4)2SO2 0.05 KCl 0.02 MgSO4 0.01 MnSO4 0.00001 FeSO4 0.00001 Agar 2
Uji Kemampuan MPK Melarutkan Kalium dan Fosfat di Media Cair
Pengujian bertujuan mendapatkan 5 MPK terbaik dari 10 MPK hasil uji sebelumnya berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan sumber kalium sukar larut. Pengujian kemampuan MPK pada media cair dalam melarutkan sumber kalium dan fosfat merupakan percobaan faktor tunggal dengan 11 perlakuan yang diulang sebanyak 3 kali. Pengujian ditempatkan dalam rancangan acak lengkap (RAL). Perlakuan adalah pemberian isolat MPK yaitu MPK0 (tanpa isolat) dan 10 isolat MPK terbaik dari uji indeks pelarutan kalium.
Pengujian dilakukan dengan mengisolasi 10 isolat mikrob pada 25 ml media tumbuh selama 7 hari. Media tumbuh yang digunakan komposisinya terdiri dari 1 % glukosa, 0.05 % yeast extract dan 0.5 % sumber kalium (feldspar) atau sumber fosfat (Ca3(PO4)2 dan batuan fosfat). Setelah 7 hari, suspensi isolat kemudian di centrifuge selama 25 menit dengan kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan supernatan dari sel mikrob dan kalium atau fosfat tidak larut, lalu supernatan diambil dan disaring.
Pengukuran kalium terlarut memodifikasi metode yang dilakukan Parmar dan Sindhu (2013) dengan mengukur supernatan menggunakan flamefotometer. Larutan standar menggunakan K titrisol. Pengukuran fosfat terlarut memodifikasi metode yang dilakukan oleh Susilowati dan Syekhfani (2014), 1 ml supernatan hasil centrifuge dicampurkan dengan larutan pereaksi (asam borat 0.5 %, ammonium molibdat 0.38 %, HCl 7.5 %) kemudian ditambahkan 5 tetes larutan pereduksi. Larutan hasil reaksi diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm serta larutan standar menggunakan KH2PO4.
Berdasarkan hasil pengukuran kalium dan fosfat pada media cair, persentase kelarutan kalium dan fosfat kemudian dihitung untuk mengetahui seberapa besar kemampuan MPK dalam melarutkan sumber kalium dan fosfat. Persentase kelarutan kalium dan fosfat dihitung dengan rumus,
Persentase kelarutan (%) = Kadar tersedia (ppm) x 100 % Kadar total pada sumber (ppm)
14
Parameter pengamatan adalah kadar kalium dan fosfat terlarut (ppm) serta persentase kalium dan fosfat terlarut (%) pada media tumbuh yang telah ditambahkan dengan sumber kalium atau sumber fosfat. Sebanyak 5 isolat yang memiliki kemampuan pelarutan kalium terbesar diambil untuk diuji pada tanaman sorgum.
Uji Kemampuan Mikrob Pelarut Kalium pada Tanaman Sorgum
Pengujian kemampuan MPK dilakukan untuk mengetahui seberapa besar kemampuan MPK dalam melarutkan kalium di tanah dari bentuk yang tidak tersedia menjadi bentuk tersedia dan pengaruhnya terhadap pertumbuhan vegetatif tanaman sorgum. Pengujian kemampuan MPK pada tanaman sorgum merupakan percobaan faktor tunggal dengan 6 perlakuan yang diulang sebanyak 3 kali. Pengujian ditempatkan dalam rancangan acak lengkap (RAL). Perlakuan adalah pemberian isolat MPK pada media penanaman yaitu P0 (tanpa isolat) dan 5 isolat terbaik dari uji pada media cair (P1, P2, P3, P4 dan P5).
Aplikasi mikrob memodifikasi metode yang dilakukan oleh Basak dan Biswas (2009) dengan modifikasi pada tanaman yang digunakan yaitu tanaman sorgum. Tanah jenis Latosol dari kebun percobaan Cikabayan sebanyak 5 kg berat kering oven dimasukkan ke dalam polibag dan masing-masing diberi 1/3 dosis pupuk anorganik berupa 100 ppm N dan 50 ppm P2O5. Aplikasi MPK dilakukan dengan membiakkan isolat pada 100 ml media NB selama 12 jam, kemudian 20 ml MPK (populasi 109 SPK/ml) pada media NB tersebut dicampur dengan 250 ml
aquadest dan diaplikasikan ke polibag perlakuan sebelum penanaman. Pada
perlakuan kontrol tidak diberi isolat MPK. Polibag tersebut kemudian ditanami benih sorgum, kelembaban tanah dijaga dengan menyiram tanah menggunakan air minim hara. Sebanyak 2/3 dari dosis pupuk N dan pupuk P diberikan ke tanaman pada umur tanaman 3 minggu setelah tanam (MST).
Pengamatan dilakukan pada saat tanaman sorgum berumur 6 MST. Tanaman sorgum yang telah diukur pertumbuhannya pada 6 MST dikeringkan dengan oven pada suhu 60 0C selama 24 jam lalu dihaluskan kemudian dianalisis kandungan kalium total pada tanaman tersebut. Tanah yang ditanami sorgum juga diukur pH tanah kemudian dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 0C selama 24 jam lalu dianalisa kandungan kalium total dan kalium tersedia tanah (Tabel 5). Parameter pengamatan yaitu tinggi tanaman (cm), jumlah daun (helai), bobot kering akar (g), bobot kering tajuk (g), pH tanah, kadar kalium tanaman (%), kadar kalium total di tanah (me/100 g) dan kadar kalium tersedia di tanah (me/100 g). Sebanyak 2 isolat yang menunjukkan hasil terbaik diambil untuk identifikasi dan karakterisasi MPK.
Tabel 5 Parameter dan metode analisis kimia tanah dan tanaman sorgum (Balittan 2005)
Parameter Metode
Ekstraksi Pengukuran
pH tanah Aquadest pH meter
K tanaman (%) Pengabuan basah Flamefotometer K total (me/100 g) HNO3 dan HClO4 Flamefotometer
15
Identifikasi dan Karakterisasi Mikrob Pelarut Kalium
a. Identifikasi MPK
Identifikasi mikrob secara molekuler dilakukan dengan metode analisa molekuler berdasarkan sekuen gen 16s rRNA (Santosa 2001; Sulandri dan Zein 2003). Tahapan identifikasi berupa ekstraksi, purifikasi, Polymerase
Chain Reaction (PCR), elektroforesis dan sekuensing DNA. Tahapan ekstraksi
dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada media luria bertani (LB) selama 3 hari, sebanyak 10 ml kultur yang telah tumbuh disetrifugasi (8000 ppm selama 10 menit). Supernatan hasil setrifugasi dibuang dan pelet dicuci untuk digunakan. Sebanyak 30 mg pelet dicampur dengan 1.5 ml yang berisi 500 µl buffer STE, kemudian pelet disuspensikan. Tambahkan 20 µl protease K (10 mg/ml) dan 50 µl larutan SDS 10 %. Suspensi selanjutnya diinkubasi dalam waterbath (55 0C selama 2 jam). Tambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl
phenol dan 400 µl CIAA, kemudian putar pelan pada temperatur ruang selama
1.5 jam lalu disentrifugasi 3000 rpm selama menit. Supernatan ditambahan 50 µl 5 M NaCl dan 1 ml etanol absolut lalu diinkubasi di freezer selama 1 jam. Setrifugasi 8000 ppm selama 5 menit, supernatan lalu dibuang kemudian tambahkan 1 ml etanol 70 % lalu setrifugasi (8000 ppm selama 5 menit) dan supernatan dibuang. Tiriskan dan keringkan sisa-sisa etanol. Tambahkan 50 µl TE kemudian simpan pada temperatur 4 0C sampai digunakan.
Purifikasi dilakukan dengan mengekstraksi 50 µl DNA ditambah 5 µl RNAase (10 mg/ml) kemudian diaduk menggunakan vortek lalu diinkubasi selama 3 jam dengan suhu 37 0C. Tambahkan 200 µl air destilasi steril, 200 µl fenol dan 200 µl kloroform lalu tabung Eppendorf yang berisi campuran DNA kemudian dibolak-balik secara perlahan. Suspensi kembali disentrifugasi (8000 ppm selama 5 menit). Supernatant dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf steril dan ditambahkan 25 µl 5 M NaCl, 500 µl etanol absolut kemudian diinkubasi pada suhu -20 0C selama 1 jam. Suspensi disentrifugasi (8000 ppm selama 10 menit), supernatan dibuang dan ditiriskan. Tambahkan 50 µl aquadest dan simpan pada temperatur 4 0C sampai digunakan.
Proses PCR diawali dengan pembuatan campuran komponen reaksi PCR sebanyak 50 µl yang terdiri dari, 5 µl 10x penyangga PCR, 4 µl 2.5 mM dNTP, 5 µl 2.5pmol/µl primer 63f (5’ –CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC– 3’), 5 µl 2.5pmol/µl primer 1387r (5’ –GGG CGG WGT GTA CAA GGC–3’), 0.25 µl taq polymerase, sampel DNA dan aquabidest steril sampai 50 µl. Running PCR dimulai dengan proses denaturasi 94 0C selama 2 menit, kemudian diikuti dengan 30 siklus denaturasi (94 0C selama 1 menit). Proses
annealing dilakukan pada suhu 45 0C selama 1 menit. Proses elongasi
dilakukan pada suhu 72 0C selama 2 menit, lalu pada siklus terakhir waktu polimerisasi diperpanjang menjadi 10 menit. Reaksi PCR dihentikan dengan menurunkan suhu menjadi 4 0C.
Proses elektroforesis dilakukan dengan membuat gel agarose dengan mencampurkan 4 gram agarosa dalam 200 ml 1x penyangga TAE, panaskan sampai mendidih. Dinginkan larutan samapi 60 0C kemudian tambahkan 5 µl etidium bromida (EtBr/C21H20BrN3) (10 mg/ml) dan aduk hingga rata. Larutan kemudian dituang ke dalam tray dan pasang well-forming combs dan tunggu sampai gel mengeras lalu lepas well-forming combs secara perlahan. Tray
16
diletakkan ke dalam tanki elektroforesis dan tuang 1x penyangga TAE hingga 1 mm diatas permukaan gel. Ambil sampel sebanyak well capacity (kapasitas sumur), letakkan diatas parafilm dan tambahkan loading dye buffer 1/10 volume sampel lalu aduk rata. Ambil larutan kemudian masukkan ke dalam sumur pada gel agarose, lalu tutup tanki dan hubungkan dengan arus listrik. Setelah proses elektroforesis selesai, tray diambil, kemudian gel ditaruh pada UV Transilluminalator.
Sekuensing DNA dilakukan dengan mengamplifikasi DNA dengan primer tunggal dan 20 µl campuran komponen reaksi dari taq polymerase. Tambahkan 100 µl aquadest ke DNA yang telah diamplifikasi. Masukkan larutan ke tabung eppendorf steril lalu tambahkan 18 µl 2 M sodium asetat dan 300 µl etanol. Setrifugasi selama 10 menit, buang supernatan secara hati-hati, sisakan kira-kira 20 sampai 30 µl dan cuci dengan etanol 70 %. Setrifugasi kembali selama 2 menit, sisakan kira-kira 20 sampai 30 µl lagi kemudian keringkan menggunakan pompa vakum. Produk PCR disekuensing menggunakan automatic DNA sequencer dan hasil sekuensing dibandingkan dengan sekuen pada European Molecular Biology Laboratory (EMBL) menggunakan piranti FASTA pada situs www.ebi.ac.uk.
b. Karakterisasi MPK
Pengamatan karakterisasi 2 MPK terbaik yang telah lolos seleksi sebelumnya terdiri dari,
Morfologi Koloni Mikrob Pelarut Kalium
Pengamatan morfologi koloni bakteri meliputi bentuk koloni, warna, elevasi (kenampakan dari samping) dan bentuk tepian (Marista et al. 2013). Pengamatan morfologi koloni fungi meliputi bentuk, warna miselium dan warna spora.
Bentuk Sel dan Pewarnaan Gram
Pengamatan bentuk sel dan pewarnaan gram dilakukan dengan cara mengambil 1 ose isolat BPK dan diletakkan diatas kaca objek, kemudian difiksasi dengan melewatkan kaca objek diatas api bunsen. Kaca objek yang berisi isolat kemudian ditetesi kristal violet dan didiamkan selama 30 detik, kemudian dibilas dengan aquadest. Kaca objek tersebut kemudian ditetesi dengan iodin, lalu didiamkan selama 1 menit, lalu bilas dengan aquadest. Kaca objek lalu ditetesi dengan alkohol 70 %, lalu dibilas dengan aquadest. Kaca objek kemudian ditetesi dengan safranin, didiamkan selama 45 detik, lalu dibilas dengan aquadest dan dikeringkan (Pelczar & Chan 1986). Kaca objek diamati di bawah mikroskop untuk melihat bentuk sel dan hasil pewarnaan gram.
Uji Biokimia
Uji biokimia BPK meliputi uji motilitas, uji katalase, uji indol, uji urea, uji fermentasi glukosa, uji pati dan uji sitrat (Faddin 1979).
1. Uji Motilitas
Isolat bakteri diinokulasikan pada media NA tegak setengah padat di dalam tabung reaksi dengan metode tusuk, kemudian diikubasi pada
17
suhu ruang selama 48 jam. Hasil inkubasi diamati dari perluasan areal tusukan. Jika areal tusukan meluas, berarti mengindikasikan bakteri tersebut bersifat motil.
2. Uji Katalase
Isolat bakteri diinokulasikan pada media NA miring dengan metode gores. Kultur hasil inkubasi kemudian ditetesi dengan H2O2 3 %, jika terbentuk gelembung maka uji dinyatakan positif.
3. Uji Indol
Isolat bakteri diinokulasikan pada media NA tegak setengah padat di dalam tabung reaksi dengan metode tusuk, kemudian diikubasi pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam. Kultur hasil inkubasi kemudian
ditetesi dengan reagen Kovac’s sebanyak 10 tetes. Warna merah yang terbentuk menunjukkan bahwa bakteri memiliki kemampuan untuk memecah asam amino triptofan.
4. Uji Urea
Isolat bakteri diinokulasikan ke dalam media Urea Broth dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam. Terbentuknya warna merah keunguan menunjukkan hasil positif karena bakteri mampu menggunakan urea dan mengubah pH menjadi basa.
5. Uji Fermentasi Glukosa
Isolat bakteri diinokulasikan ke dalam media pertumbuhan cair yang masing-masing mengandung glukosa 2 % kemudian diinkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam. Indikasi sifat fermentasi glukosa terjadi jika terbentuk gas pada tabung durham.
6. Uji Pati
Isolat bakteri diinokulasi pada media agar lempeng pati kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam. Kultur bakteri hasil inkubasi kemudian ditambahkan larutan yodium dan dibiarkan selama 30 detik. Munculnya warna biru kehitaman di sekeliling tumbuhnya biakan merupakan indikasi bahwa bakteri tersebut mampu menghidrolisis pati. 7. Uji Sitrat
Isolat bakteri diiokulasikan pada media agar miring Simmon’s
Citrat dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam.
Perubahan warna media dari hijau menjadi biru menunjukkan hasil positif, dikarenakan bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai sumber energi.
Analisis Data
Analisis data dilakukan secara tabulasi pada data kualitatif, sedangkan pada data kuantitatif yang memerlukan analisa statistik, analisa akan menggunakan analisa sidik ragam (ANOVA) pada taraf nyata 5 %. Hasil analisia yang menunjukkan pengaruh nyata pada perlakuan, diuji lanjut dengan uji lanjut DMRT (Duncan’s Multiple Range Test) pada taraf nyata 5 %.
18