4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menggunakan pretest-postest control group design (Pocock, 2008). Adapun skema penelitian dapat digambarkan sebagai berikut:
01 P0 02 P S R
03 P1 04 Gambar 4.1 Bagan Rancangan Penelitian
Keterangan :
P = Populasi
S = Sampel
R = Randomisasi
01 = Pemeriksaan awal sel-sel spermatogenik pada kelompok kontrol.
02 = Pemeriksaan sel-sel spermatogenik pada kelompok kontrol setelah 35 hari pasca induksi pelatihan fisik berlebih tanpa pemberian astaxanthin.
03 = Pemeriksaan awal sel-sel spermatogenik pada kelompok perlakuan. 04 P0 P1 = = =
Pemeriksaan sel-sel spermatogenik pada kelompok perlakuan setelah 35 hari pasca pelatihan fisik berlebih dengan pemberian astaxanthin.
Perlakuan pada kelompok kontrol dengan pemberian plasebo (gliserin) 0,5 cc pasca induksi pelatihan fisik berlebih.
Perlakuan pada kelompok perlakuan dengan pemberian astaxanthin 0,01 mg dalam larutan gliserin 0,5 cc per hari pasca induksi pelatihan fisik berlebih.
Penelitian ini dilakukan di Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana, dan pemeriksaan histopatologi dikerjakan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Udayana. Penelitian dilaksanakan pada bulan April sampai Juni 2011.
4.3 Penentuan Sumber Data 4.3.1 Kriteria Sampel Penelitian
Sampel dalam penelitian ini adalah mencit jantan dewasa dengan kriteria sebagai berikut :
4.3.1.1 Kriteria inklusi
Berat badan 20-22 gram Umur 2 – 3 bulan
Sehat, satu hibrid, Galur Balb-C 4.3.1.2 Kriteria eksklusi
Mencit tidak mau makan. 4.3.1.3 Kriteria Drop Out
Mencit sakit atau mati saat penelitian berlangsung.
4.3.2 Besar Sampel
Besar sampel yang akan diperlukan dalam penelitian ini didasarkan pada rumus Pocock (2008): 2σ2 n = _____ x f (α, β) (µ2 - µ1)2 Keterangan : n : jumlah sampel
δ : standar deviasi (SD) kelompok perlakuan
µ1 :rerata hasil Spermatid 7 pada kelompok setelah perlakuan µ2 : rerata hasil Spermatid 7 pada kelompok sebelum perlakuan f (α,β) : besarnya didapat dari tabel Pocock (2008)
Dari penelitian Pusparini (2010) terhadap proses spermatogenesis mencit dengan pemberian beta karoten oral setelah diinduksi pelatihan fisik berlebih, didapatkan data :
1. Standar deviasi (δ) kelompok perlakuan = 7,37
2. Rerata hasil Spermatid 7 pada kelompok pre-test (µ2) = 104,91 3. Rerata hasil Spermatid 7 pada kelompok post-test (µ1) = 99,90 4. f (α,β) = besarnya dilihat pada tabel Pocock sebesar 10,5
Jadi jumlah sampel (n) yang didapat 6,17 dibulatkan menjadi 7. dan ditambah 1 ekor mencit untuk masing-masing kelompok sebagai cadangan. Dalam hal ini, pada masing-masing kelompok terdapat 8 ekor mencit, sehingga jumlah mencit yang diperlukan adalah 32 ekor.
4.3.3 Teknik Pengambilan Sampel
Oleh karena sampel ini bersifat homogen yaitu mencit jantan yang memenuhi syarat sebagai sampel penelitian berdasarkan kriteria inklusi, maka diambil secara acak sederhana untuk mendapatkan jumlah sampel. Sampel yang dipilih dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok yang diinduksi pelatihan fisik berlebih tanpa diberi astaxanthin, dan kelompok perlakuan yang diinduksi pelatihan fisik berlebih dengan pemberian astaxanthin 0,01 mg.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Identifikasi Variabel
Variabel yang diukur adalah jumlah sel spermatogonium A, spermatosit pakhiten, spermatid 7 dan spermatid 16 setelah perlakuan selama 35 hari.
4.4.2 Klasifikasi Variabel
4.4.2.1 Variabel Bebas : Astaxanthin oral
4.4.2.2 Variabel Tergantung : Jumlah sel Spermatogonium A, Spermatosit Pakhiten, Spermatid 7, Spermatid 16.
4.4.2.3 Variabel Kendali : Strain mencit Balb C, jenis kelamin, umur, berat badan, lingkungan (suhu, cahaya, dan kelembaban).
4.4.3 Definisi Operasional Variabel
4.4.3.1 Pelatihan fisik berlebih pada mencit adalah waktu pelatihan yang diukur berdasarkan waktu maksimal kemampuan renang mencit pada ember berdiameter 35 cm dengan kedalaman air 20 cm, yang dilakukan setiap hari selama 60 menit atau hampir tenggelam (Binekada, 2002), dengan lama pelatihan 35 hari.
4.4.3.2 Astaxanthin oral adalah konsentrasi sediaan antioksidan dalam bentuk serbuk yang dilarutkan dengan gliserin sehingga menjadi 0,5 ml yang diberikan satu kali sehari secara oral melalui zonde, dan diberikan setelah dilakukan pelatihan fisik berlebih.
Dosis pemberian astaxanthin mengacu pada kebutuhan astaxanthin bagi orang dewasa yaitu 4 mg/hari. Berdasarkan tabel konversi perhitungan dosis menurut Laurance dan Bacharah (Get dan Barnes, 1994), maka perhitungan konversi untuk astaxanthin adalah sebagai berikut :
Dosis manusia dewasa (rata-rata berat 70 kg) = 4 mg Dosis mencit 20 gr = 0,0026 x 4 mg = 0,0104 mg
Jadi dosis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah 0,01 mg per hari.
4.4.3.3 Sel-sel spermatogenik yaitu jumlah sel-sel spermatogonium A dengan 5 lapangan pandang. Hasil penghitungan yang diperoleh adalah hasil rata-rata dari semua pengamatan. Jumlah sel berbentuk bulat, dekat lamina basalis, inti lonjong, oval, kromatin halus, dan selaput inti tipis.
4.4.3.4 Jumlah sel spermatosit pakhiten yaitu jumlah sel berbentuk bulat, besar, inti gelap dengan kromosom yang jelas dalam 5 lapangan pandang secara mikroskopis. Hasil penghitungan yang diperoleh adalah rata-rata dari semua pengamatan.
4.4.3.5 Jumlah sel spermatid 7 yaitu jumlah sel berbentuk bulat, lebih kecil dari spermatosit pakhiten, inti bulat, pucat, dan terang, yang diamati dalam 5
lapangan pandang secara
mikroskopis. Hasil penghitungan yang
diperoleh adalah rata-rata dari semua
pengamatan..
4.4.3.6 Jumlah sel spermatid 16 yaitu jumlah
sel yang menunjukkan spermatozoa
yang telah lengkap sempurna, berada
dekat lumen dengan ekor menghadap ke
lumen, yang diamati dalam 5 lapangan
pandang secara mikroskopis. Hasil
penghitungan yang diperoleh adalah rata-rata dari semua pengamatan. 4.4.3.7 Berat badan adalah berat badan mencit jantan yang ditimbang dengan
timbangan gram.
4.4.3.8 Umur mencit ditentukan dengan melihat tanggal kelahiran yang telah dicatat pada kandang percobaan.
4.4.3.9 Cahaya, suhu, dan kelembaban merupakan kondisi lingkungan yang dialami mencit. Pada penelitian kondisi lingkungan disamakan dengan mengandangkan mencit pada satu lingkungan dengan cahaya, suhu, dan kelembaban yang sama. Cahaya yang digunakan berupa cahaya lampu neon 10 watt, suhu kamar 250 C dan kelembaban 70%.
4.4.4 Hubungan Antar Variabel
Gambar 4.2 : Bagan Hubungan Antar Variabel
4.5 Alat dan Bahan 4.5.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam pengambilan data penelitian adalah sebagai berikut :
1. Kandang mencit terbuat dari besi, di dalamnya terdapat sekam dan botol minuman.
Variabel Bebas
Astaxanthin oral
Variabel Tergantung Spermatogenesis:
Jumlah sel-sel spermatogenik (Spermatogonium A,
Spermatosit Pakhiten, Spermatid 7, spermatid 16). Variabel kendali
Strain ,Berat badan, Lingkungan, Kesehatan
2. Ember berdiameter 35 cm dan kedalaman air 20 cm. 3. Mikroskop elektrik.
4. Stop watch. 5. Timbangan. 6. Spuit injeksi 1 ml.
7. Slang plastik, panjang ± 2 cm.
8. Alat bedah minor (bak parafin, pisau bedah, pinset dan gunting bedah). 9. Duplex Tissue Prosessor.
10. Peralatan untuk sediaan histologis seperti mikroton, oven, scalpel, holder, spatula, hotplate, staining jar, obyek gelas dan kaca penutup.
4.5.2 Bahan Penelitian
1. Astaxanthin 4 mg , larutan gliserin 2. Mencit putih jantan.
3. Makanan mencit berupa pellet dan air minum dari ledeng. 4. Larutan buffer formalin 10%.
5. Bahan kimia untuk pembuatan sediaan histologis antara lain alkohol 70%, alkohol 75%, alkohol 95/96%, alkohol 100%, xylol, parafin cair, bahan pewarna hematoxylin-eosin, entelan.
4.6 Prosedur Penelitian 4.6.1 Persiapan Hewan Coba
Mencit jantan dewasa, strain Balb-C, sehat, berumur dua sampai tiga bulan dengan berat badan 20-22 gram , dilakukan aklitimatisasi selama satu minggu di tempat penelitian untuk penyesuaian dengan lingkungan. Setelah itu, mencit-mencit akan dikelompokkan secara random menjadi dua kelompok, dan masing-masing kelompok dimasukkan ke dalam kandang yang terbuat dari besi.
4.6.2 Pemberian Perlakuan
1. Perlakuan diberikan setelah hewan coba diadaptasikan dalam kandang selama tujuh hari, yaitu kelompok P0 tanpa diberi astaxanthin pasca diinduksi pelatihan fisik berlebih, dan kelompok P1 diberi astaxanthin 0,01 mg pasca diinduksi pelatihan fisik berlebih, kemudian dimasukkan dalam kandang masing-masing kelompok. Selama perlakuan hewan coba diberikan makan dan minum secara teratur, kebersihan dan kenyamanan kandang dijaga.
2. Sebelum perlakuan delapan ekor mencit pada masing-masing kelompok dilakukan pembedahan untuk pemeriksaan histologis pada kelompok pre-test.
Setelah dilakukan pembedahan untuk pengambilan testis, mencit tersebut dikubur supaya tidak menimbulkan bau tidak sedap serta efek negatifnya. 3. Kemudian sisa mencit delapan ekor pada masing-masing kelompok diberi
perlakuan berupa pelatihan fisik berlebih dengan cara merenangkan mencit selama 60 menit atau sampai hampir tenggelam, dilakukan setiap hari selama 35 hari. Selama perlakuan pelatihan fisik berlebih, mencit diberi plasebo (gliserin) pada kelompok kontrol, astaxanthin 0,01 mg pada kelompok perlakuan.
4. Hari ke-36, delapan ekor mencit pada masing-masing kelompok dibedah dan diambil testisnya untuk pemeriksaan histopatologi (post-test).
4.6.3 Alur Penelitian
Gambar 4.3 Bagan Alur Penelitian
4.6.4 Cara Membuat Sediaan Mikroskopis
Mencit dipingsankan dengan eter, kemudian daerah perineum dibuka dengan gunting bedah secara hati-hati lalu testis diangkat. Testis dipisahkan kemudian difiksasi pada larutan buffer formalin 10% selama 3 jam, lalu dilakukan dehidrasi. Mula-mula alkohol 70% selama ½ jam, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 95% selama ½ jam, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 100% pertama (I) selama ½ jam, kedua (II) selama 1 jam, ketiga (III) selama 1 jam dan keempat (IV) selama 1 jam. Kemudian proses clearing dimasukkan ke dalam xylol pertama (I) selama 1 jam dan xylol kedua (II) selama 4 jam. Kemudian dibuat blok parafin dan disimpan dalam almari es. Selanjutnya dilakukan pewarnaan (stainning). Pewarnaan sediaan testis dengan Hematoxylin-Eosin (HE), dengan cara pertama deparafinisasi dengan xylol, hidrasi dengan serial alkohol 100% (2 x 2 menit)
-Mencit (32 ekor) Kontrol (16 ekor) Perlakuan (16 ekor) Pre-Test (8 ekor) Pre-Test (8 ekor) Pelatihan fisik berlebih
dan pemberian plasebo 0,5 ml & (8 ekor)
Pelatihan fisik berlebih dan pemberian astaxanthin
0,01 mg (8 ekor) Post-Test (8 ekor) Post-Test (8 ekor) Histopatologi Jumlah sel spermatogenik Histopatologi Jumlah sel Spermatogenik
95% (2 menit) – 80% (2 menit) – 70% (2 menit) kemudian diwarnai dengan hematoxylin selama 1 menit, lalu dicuci dengan air keran beberapa menit sampai air bersih, lalu diwarnai dengan eosin biarkan selama 5 menit, lalu cuci 2 kali dengan alkohol 75%, kemudian dilakukan dehidrasi dengan alkohol 95%, kemudian bersihkan dengan xylol sebanyak 2 kali masing-masing 5 menit selanjutnya dilakukan mounting menggunakan entelan (Jusuf, 2009).
4.6.5 Cara Pengumpulan Data
Data yang dikumpulkan pada penelitian ini diperoleh dari :
1. Hasil pemeriksaan pre-test terhadap masing-masing kelompok yang diambil testisnya dan diamati secara mikroskopis.
2. Hasil pemeriksaan post-test terhadap kedua kelompok yang diambil testisnya diamati secara mikroskopis.
Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah sel-sel spermatogenik secara mikroskopis dengan pembesaran 400 kali dan 1000 kali pada testis kanan dan kiri. Dipilih tubulus seminiferus VII dan VIII yang terpotong melintang tegak lurus sehingga penampang tubulus tampak bulat.
4.7 Analisis Data
Hasil pengamatan spermatogenesis dianalisis dengan langkah-langkah sebagai berikut :
4.7.1 Analisis Deskriptif.
4.7.2 Uji Normalitas data dilakukan dengan Shapiro-Wilk, didapat data berdistribusi normal dengan nilai p> 0,05.
4.7.3 Uji Homogenitas antar kelompok dengan Levene’s Test, didapat hasil varian antar kelompok homogen dengan nilai p> 0,05.
4.7.4 Uji Komparabilitas.
Karena data yang diperoleh berdistribusi normal, maka analisis yang digunakan meliputi :
a. Independent t-test, untuk membandingkan pre-test kelompok kontrol dengan pre-test kelompok perlakuan, dan post-test kelompok kontrol dengan post-test kelompok perlakuan.
b. Paired t-test, untuk analisis perbandingan pre-test kelompok kontrol dengan post-test kelompok kontrol, dan pre-test kelompok perlakuan dengan post-test kelompok perlakuan.
4.7.5 Analisis data menggunakan tingkat kepercayaan 95% atau dinyatakan berbeda bila p< 0,05.
BAB V