METODE PENELITIAN
4.1.Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental dengan rancangan
Posttest Only Control Group Design dengan alasan untuk mengetahui pengaruh lama kontak dan konsentrasi air perasan jeruk nipis terhadap pertumbuhan
Streptococcus pyogenes. Dalam rancangan ini perlakuan atau intervensi telah dilakukan, kemudian dilakukan pengukuran (observasi) atau posttest (Notoatmodjo, 2010).
4.2.Lokasi dan Waktu Penelitian 4.2.1. Lokasi Penelitian
Lokasi pelaksanaan penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
4.2.2. Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama 3 bulan, yaitu mulai bulan September 2015 sampai dengan bulan November 2015.
4.3.Sampel Penelitian
Sampel dalam penelitian ini adalah biakan spesimen-spesimen yang telah diidentifikasi sebagai bakteri Streptococcus pyogenes yang diambil dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran USU. Penentuan jumlah sampel dalam penelitian ini menggunakan rumus Federer, yaitu:
Keterangan:
t = banyak perlakuan r = jumlah replikasi
Dalam penelitian ini dilakukan 7 perlakuan (kelompok), yaitu pemberian air perasan jeruk nipis konsentrasi 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; dan 100% dan perlakuan terhadap kontrol, yaitu kontrol negatif berupa aquades steril dan kontrol
positif berupa suspensi levofloxacin. Perlakuan terhadap kontrol hanya dilakukan 1 kali. Berdasarkan rumus tersebut, didapatkan:
(7 – 1) (r – 1) 6 (r – 1)
6 r – 6 r 3,5
Jumlah sampel untuk masing-masing kelompok adalah 3,5 sampel bakteri Streptococcus pyogenes. Jika dibulatkan maka jumlah sampel untuk masing-masing kelompok adalah 4 sampel bakteri Streptococcus pyogenes.
4.4.Variabel Penelitian 4.4.1. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah air perasan jeruk nipis dengan konsentrasi 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; dan 100%.
4.4.2. Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah diameter zona hambat pertumbuhan Streptococcus pyogenes pada media Mueller Hinton di sekitar cakram setelah kontak selama 24 jam (inkubasi) dengan air perasan jeruk nipis dengan konsentrasi 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; dan 100%.
4.5.Teknik Pengumpulan Data 4.5.1. Jenis Data Penelitian
Jenis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data primer, yaitu data yang diambil selama pengujian daya hambat air jeruk nipis (Citrus aurantifolia) terhadap S. pyogenes di Laboratorium Mikrobiologi FK USU.
4.5.2. Alat dan Bahan 1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu:
- Ose - Kapas lidi
- Inkubator - Pisau
- Hot air oven - Pelubang kertas steril
- Tabung reaksi - Pinset
- Jangka sorong - Spidol
- Rak tabung reaksi - Kertas saring
- Cawan petri - Mikropipet
- Labu Erlenmeyer - Biological Safety Cabinet (BSC) - Botol steril tertutup
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: - Mueller Hinton Agar (MHA)
- Air Perasan Jeruk nipis (Citrus Aurantifolia) - Biakan bakteri Streptococcus pyogenes
- Aquabides
- Levofloxacin disc
4.5.3. Prosedur dan Teknik Penelitian 1. Persiapan bakteri
Koloni bakteri Streptococcus pyogenes diperoleh dari hasil biakan spesimen-spesimen yang telah diidentifikasikan dengan metode standar di Laboratorium Mikrobiologi FK USU.
2. Pembuatan perasan jeruk nipis
Jeruk nipis yang segar di cuci dengan menggunakan air yang bersih. Kemudian, jeruk nipis dipotong dengan menggunakan pisau yang steril, diperas dan disaring airnya menggunakan kain steril ke dalam labu Erlenmeyer steril, lalu ditutup dengan aluminium foil steril dan disimpan pada suhu 4ºC sampai saat digunakan. Kemudian, blank disc direndam pada setiap konsentrasi yang telah ditentukan selama 10-15 menit (Taiwo et al., 2007). 3. Pembuatan konsentrasi air jeruk nipis
Menurut Suswanti dan Nurfida (2009) dalam Pradani (2012), cara pembuatan perasan jeruk nipis dengan konsentrasi 100% didapatkan dari perasan
jeruk nipis sebanyak 4 ml tanpa menambahkan bahan apapun yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi I. Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dengan kelipatan setengahnya sampai didapatkan larutan konsentrasi 6,25% dan divortex selama 60 detik. Dari larutan konsentrasi 100% diambil sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi II yang sudah diisi dengan 1 ml aquades steril kemudian divortex selama 60 detik sehingga didapatkan konsentrasi 50%. Dari larutan konsentrasi 50 % diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi III yang sudah diisi dengan 1 ml aquades steril kemudian divortex selama 60 detik sehingga didapatkan konsentrasi 25%. Dari larutan konsentrasi 25% diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi IV yang sudah diisi dengan 1 ml aquades steril kemudian divortex selama 60 detik sehingga didapatkan konsentrasi 12,5%. Dari larutan konsentrasi 12,5% diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi V yang sudah diisi dengan 1 ml aquades steril kemudian divortex selama 60 detik sehingga didapatkan konsentrasi 6,25%. Beri label pada tabung untuk setiap kali pengenceran sesuai dengan konsentrasinya.
4. Uji kepekaan dengan cara difusi
- Siapkan lempeng agar dalam cawan petri yang mengandung koloni bakteri yang telah diidentifikasikan sebagai Streptococcus pyogenes.
- Ambil koloni bakteri yang akan diuji kepekaannya dan dimasukkan ke medium cair dalam tabung reaksi, eramkan 2-5 jam pada suhu 36-37ºC.
- Buat suspensi bakteri dengan kekeruhan sesuai dengan Nephelometer Mcfarland 0,5
- Celupkan swab kapas steril ke dalam suspensi yang terdapat dalam tabung reaksi.
- Dengan gerakan menekan dan memutar kapas lidi steril tersebut pada dinding tabung.
- Kemudian swab tersebut diusapkan pada permukaan lempeng agar Mueller Hinton dan sebarkan secara merata pada permukaan agar tersebut. Diamkan selama 3-5 menit sampai mengering.
- Letakkan cakram yang telah diberi air perasan jeruk nipis pada permukaan agar dengan bantuan pinset steril.
- Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam.
- Periksa Zona Hambat di sekitar cakram antimikroba dan kertas cakram jeruk nipis tersebut yang tidak ditumbuhi oleh koloni bakteri dan diukur diameternya dengan jangka sorong (caliper) atau penggaris dan disesuaikan pembacaannya berpedoman pada tabel CLSI M100-S22 untuk
Streptococcus pyogenes (Kumala, 2006).
4.6.Pengolahan dan Analisa Data
Data yang telah di kumpulkan dari setiap pengukuran disajikan dalam bentuk tabel untuk mempermudah pengolahan dan pembahasan. Data yang diperoleh akan dianalisis menggunakan analisis regeresi linier. Sebelumnya dilakukan uji normalitas Kolmogorov-Smirnov dan uji homogenitas Levene.
Kemudian dilakukan uji Post Hoc multiple comparisons dengan metode Mann- Whitney untuk melihat ada perbedaan atau tidak pada masing-masing perlakuan terhadap perlakuan yang lain maupun terhadap kontrol yang ada.