A. Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorium dengan menggunakan rancangan penelitian the pre and post test control group design.
B. Lokasi Penelitian.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi Universitas Setia Budi Surakarta.
C. Subjek Penelitian
Tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Wistar, sehat, memiliki aktivitas normal, dan berusia 2-3 bulan dengan berat +200 gram (Sugiyanto, 1995). Tikus tersebut didapatkan dari Unit Pengembangan Hewan Coba Universitas Setia Budi Surakarta.
D. Teknik Sampling
Hewan coba dibagi dalam 5 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Kelompok 1 sebagai kelompok kontrol positif, kelompok 2 sebagai kontrol negatif, kelompok 3 sebagai kelompok perlakuan pertama, kelompok 4 sebagai kelompok perlakuan kedua, dan kelompok 5 sebagai kelompok perlakuan ketiga.
Subjek dibagi ke dalam 5 kelompok yang besar minimal untuk tiap kelompok ditentukan dengan rumus Federer, yaitu:
commit to user
dengan n adalah besar sampel dan t adalah jumlah kelompok perlakuan. Maka, perhitungannya adalah sebagai berikut:
(n-1)(5-1) > 15 4n-4 > 15 4n > 19 n > 4,75 (=5)
Jadi, jumlah tikus yang digunakan adalah 5 ekor per kelompok dan totalnya adalah 25 ekor. Sebagai cadangan, setiap kelompok ditambahkan satu ekor tikus, sehingga total tikus menjadi 30 ekor.Pengambilan subjek sebanyak 30 ekor dilakukan secara simple random sampling.
E. Identifikasi Variabel 1. Variabel Bebas
Jus buah Naga Putih (Hylocereus undatus) 2. Variabel Terikat
Kadar HDL tikus putih 3. Variabel Luar
a. Dapat dikendalikan
Makanan hiperkolestrolemik, minuman, jenis kelamin, umur, berat badan, galur.
b. Tidak dapat dikendalikan
commit to user F. Rancangan Penelitian
Tikus putih 30 ekor
Kelompok kontrol positif (6 ekor) Kelompok kontrol negatif (6 ekor) Kelompok perlakuan 1 (6 ekor) Kelompok perlakuan 2 (6 ekor) Kelompok perlakuan 3 (6 ekor)
Simple Random Sampling
Kelompok 1 Pelet 20gr/200gr BB + Pakan hiperkolestrol 2,5 ml/200gr BB + Simvastatin Kelompok 2 Pelet 20gr/200gr BB + Pakan hiperkolestrol 2,5 ml/200gr BB Kelompok 3 Pelet 20gr/200gr BB + Pakan hiperkolestrol 2,5 ml/200gr BB +
Jus buah Naga Putih 3,6 gr Kelompok 4 Pelet 20gr/200gr BB + Pakan hiperkolestrol 2,5 ml/200gr BB +
Jus buah Naga Putih 7,2 gr Kelompok 5 Pelet 20gr/200gr BB + Pakan hiperkolestrol 2,5 ml/200gr BB +
Jus buah Naga Putih 10,8 gr Adaptasi selama 7 hari
Induksi kolesterol 7 hari
Pengukuran kadar HDL pre test
Pengukuran kadar HDL post test
Uji Statistik Hari ke-1 s/d 7 Hari ke-8 s/d 14 Hari ke-15 Hari ke-15 s/d 35 Hari ke-36 Hari ke-1
commit to user G. Definisi Operasional Variabel
1. Variabel Bebas
a. Pemberian Jus Buah Naga Putih
Jus buah Naga Putih yang digunakan berasal dari buah Naga Putih yang dibeli di Pasar Gedhe Surakarta. Buah Naga Putih seberat 400-500 gram dihaluskan dengan menggunakan blender. Dosis jus buah Naga Putih yang digunakan pada manusia adalah 400 gram, setara dengan dosis terapi buah Naga Merah yang digunakan untuk menurunkan lipid darah (Fazila et al., 2006). Dalam penelitian ini digunakan 3 dosis jus buah Naga Putih, yaitu dosis 50% (dosis I), 100% (dosis II), dan 150% (Dosis III). Konversi dosis dari manusia (70 kg) terhadap tikus putih (200g) adalah 0,018 ditunjukan dalam Lampiran A (Soehardjono, 1993). Perhitungannya adalah sebagai berikut:
1) Jus buah Naga Putih dengan dosis I (50%) adalah 50% x 7,2 gr = 3,6 gr/200 gr BB tikus.
2) Jus buah Naga Putih dengan dosis II (100%) adalah 400 gr x 0,018 = 7,2 gr/200 gr BB tikus.
3) Jus buah Naga Putih dengan dosis III (150%) adalah 150% x 7,2 gr = 10,8 gr/200 gr BB tikus.
Volume pemberian cairan maksimal untuk tikus putih adalah 5 ml ditunjukan dalam lampiranB (Lucia, 2007) sehingga volume aquadest yang digunakan untuk membuat campuran jus buah Naga
commit to user
Putih digunakan volume 2,5 ml. Variabel ini merupakan variabel ordinal.
2. Variabel Terikat
Dalam penelitian ini, yang diukur adalah kadar HDL. Kadar HDL tikus putih diukur 2 kali, yaitu sebelum perlakuan (pre test) pada hari ke-15dan setelah perlakuan (post test) pada hari ke-36. Sebelum pengambilan darah, tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam. Pengambilan darah dilakukan dengan cara mengambil darah dari sinus orbitalis dengan pipet mikrokapiler, lalu darah ditampung dalam tabung sentrifuge. Darah disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 3000 rpm sehingga didapatkan serum darah untuk diperiksa kadar HDL di laboratorium klinik dengan menggunakan metode spectrophotometry. Variabel ini merupakan variabel rasio. 3. Variabel Luar
a. Dapat dikendalikan
1) Makanan dan minuman
a) Pakan hiperkolesterolemik
Pembuatan pakan hiperkolesterolemik dilakukan dengan cara mencampur kuning telur bebek, minyak babi, minyak kelapa, dan serbuk kolesterol (5 ml kuning telur, 10 ml minyak babi, 1 ml minyak kelapa, dan 0,1 gram serbuk kolesterol) sehingga didapatkan suatu campuran berbentuk cair. Pembuatan pakan
commit to user
hiperkolesterolemik dilakukan dua hari sekali. Pakan hiperkolesterolemik diberikan secara oral menggunakan sonde lambung.
b) Minuman
Tikus membutuhkan minum 20-45 ml air tiap hari (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988). Air minum yang berasal dari PAM ad libitum. Air minum biasanya disediakan dalam tempat minum tikus secara terus menerus untuk memenuhi kebutuhan tikus.
2) Simvastatin
Simvastatin berfungsi untuk meningkatkan kadar HDL. Simvastatin diberikan hanya pada kelompok 1 pada hari ke-15-35. Dosis terapi maksimal simvastatin untuk manusia dewasa ialah 40 mg sehari (Katzung, 2002). Konversi dosis dari manusia (70 kg) terhadap tikus putih (200 gr) adalah 0,018 (Soehardjono, 1993). Maka dosis simvastatin yang digunakan untuk tikus putih dengan berat kurang lebih 200 gr ialah 0,018 x 40 mg = 0,72 mg.
3) Galur
Semua tikus putih yang digunakan berasal dari satu galur yang sama, yaitu galur Wistar.
commit to user 4) Jenis kelamin
Semua tikus putih berkelamin jantan dapat memberikan hasil penelitian yang lebih stabil kerena tidak dipengaruhi siklus menstruasi dan kehamilan.
5) Umur
Umur tikus putih memiliki arti penting terutama dalam pengukuran kadar kolesterol. Pada usia 6 minggu, semua kadar kolesterol tikus putih akan meningkat kemudian menurun beberapa minggu dan mencapai kadar minimum pada usia 12 minggu, setelah itu meningkat lagi (Kritchevsky, 1996). Tikus putih usia + 3 bulan merupakan umur yang ideal untuk penelitian.
b. Tidak dapat dikendalikan 1) Makanan standar
Makanan standar diberikan pada tikus dua kali sehari, setiap pagi (pukul 7.00) dan sore (pukul 13.00) berupa pelet secara ad libitum.
2) Kondisi psikologis (stres)
Kondisi psikologis tikus dipengaruhi lingkungan sekitar, karena lingkungan yang terlalu gaduh atau ramai, pemberian perlakuan yang berulang kali dan perkelahian antar tikus dapat mempengaruhi kondisi psikologis tikus.
commit to user 3) Penyakit hati
Penyakit hati dapat menimbulkan gangguan pada metabolisme HDL. Faktor ini merupakan faktor yang tidak dapat dikendalikan karena sulitnya pendeteksian dini dan membutuhkan pemeriksaan terlebih dahulu.
H. Instrumentasi dan Bahan Penelitian 1. Alat
a. Kandang hewan percobaan beserta kelengkapan pemberian makanan
b. Timbangan neraca c. Sonde lambung d. Blender
e. Gelas ukur 25 dan 50 ml f. Spuit injeksi 1 ml g. Rak tabung reaksi h. Tabung mikrokapiler i. Spectrophotometer 2. Bahan
a. Buah Naga Putih
b. Makanan standard menggunakan pelet c. Pakan hiperkolestrolemik
d. Simvastatin e. Aquades
commit to user I. Cara Kerja
1. Persiapan a. Hari 1
Menyiapkan 30 ekor tikus putih galur wistar berat +200 gram serta alat dan bahan yang akan dipakai. Tikus kemudian dibagi menjadi lima kelompok, yaitu Kelompok 1 (kontrol positif), Kelompok 2 (kontrol negatif), Kelompok 3 (dosis buah I), Kelompok 4 (dosis buah II), dan Kelompok 5 (dosis buah III) dengan masing-masing kelompok terdiri atas enam ekor tikus.
b. Hari 1-7
Tikus dibiarkan beradaptasi dengan lingkungannya selama 7 hari. 2. Perlakuan
a. Hari 8-14
Setiap kelompok diberi pakan standar danpakan hiperkolestrolemik selama 7 hari. Pakan standar diberikan setiap pukul 7.00 dan 13.00 secaraad libitum. Pakan hiperkolestrolemik diberikan per oral dua kali sehari pagi (pukul 9.00) dan sore(pukul 15.00) dengan sonde lambung sesuai dosis yang telah ditentukan.
b. Hari ke 15
Kadar HDL diukur setelah tikus dipuasakan selama 12 jam. c. Hari 15-35
commit to user
Kelompok 1 : Diberikan pakan standar (pukul 7.00 dan 13.00), diet tinggi lemak dua kali sehari (pukul 11.00 dan 17.00) sebanyak2,5 ml, simvastatin 0,72 mg (pukul 9.00), dan aquades.
Kelompok 2 : Diberikan pakan standar (pukul 7.00 dan 13.00), diet tinggi lemak dua kali sehari (pukul 11.00 dan 17.00) sebanyak2,5 ml, dan aquades.
Kelompok 3 : Diberikan pakan standar (pukul 7.00 dan 13.00), diet tinggi lemak dua kali sehari (pukul 11.00 dan 17.00) sebanyak 2,5 ml, jus buah Naga Putih dosis I 3,6 gr (pukul 9.00), dan aquades. Kelompok 4 : Diberikan pakan standar(pukul 7.00 dan 13.00),
diet tinggi lemak dua kali sehari (pukul 11.00 dan 17.00) sebanyak 2,5 ml, jus buah Naga Putih dosis II 7,2 gr (pukul 9.00 dan 15.00), dan aquades.
Kelompok 5 : Diberikan pakan standar(pukul 7.00 dan 13.00), diet tinggi lemak dua kali sehari (pukul 11.00 dan 17.00) sebanyak 2,5 ml, jus buah Naga Putih dosis III 10,8 gr (pukul 9.00 dan 15.00) dan aquades.
d. Hari ke 28
commit to user 3. Pengukuran kadar HDL
a. Tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam, kemudian darah diambil dari sinus orbitalis kurang lebih sebanyak 3 ml.
b. Setelah darah yang tertampung dalam tabung mikrohematokrit dirasa cukup (3 ml), masukkan ke dalam tabung sentrifuge. Darah dalam tabung sentrifuge dipusingkan selama 15-20 menit dengan kecepatan 3000 rpm maka akan didapatkan serum darah untuk diperiksa kadar HDL. Kadar HDL diukur dengan metode spectrophotometry.
J. Teknik Analisis Data
Data yang diperoleh mengenai kadar HDLpre test dan post test antara 5 kelompok perlakuan dianalisis menggunakan uji normalitas dan homogenitas. Apabila didapatkan hasil distribusi data normal dan variansi yang homogen, maka analisis dilanjutkan menggunakan uji parametrik, yaitu uji one-way ANOVA. Jika terdapat perbedaan yang bermakna, maka analisis dilanjutkan dengan Post Hoc Test. Apabila didapatkan hasil disribusi data tidak normal dan atau variansi data yang tidak homogen, maka analisis data menggunakan uji non-parametrik, yaitu uji Friedman. Jika terdapat perbedaan yang bermakna, maka analisis dilanjutkan dengan uji Wilcoxon. Sedangkan data perbedaan kadar HDL antara pre test dan post test pada tiap-tiap kelompok digunakan uji t berpasangan. Seluruh analisis data dilakukan dengan aplikasi SPSS 17.0 for Windows dengan
commit to user BAB IV