METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu
Penelitian telah dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Universitas Sumatera Utara dimulai dari tanggal 30 Mei sampai dengan 22 Juli 2009.
3.2. Variabel Penelitian 3.2.1. Variabel Independen a. Monosodium Glutamate (MSG). b. Vitamin C. 3.2.2. Variabel Dependen a. Jumlah sperma. b. Morfologi sperma. 3.3. Definisi Operasional
a. Jumlah sperma adalah banyaknya sperma yang diperoleh dari cauda
epididimis dalam sperma/ml suspensi.
b. Morfologi sperma normal dan abnormal yang diperoleh dari cauda
epididimis.
1) Morfologi sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus.
2) Morfologi sperma abnormal mempunyai bentuk kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan (amorphous), atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala (Washington et al., 1983).
3.4. Bahan dan Alat Penelitian 3.4.1. Bahan Penelitian
Bahan biologis. Bahan biologis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus L.) strain DD Webster dewasa fertil berumur ± 3 bulan dengan berat badan 25-35 gram yang diperoleh dari Unit Pra Klinik LPPT Universitas Gajah Mada (UGM) Yogyakarta. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus (t-1) (n-1) ≥ 15. ϑικα t adalah jumlah perlakuan (dalam penelitian ini ada 5 kelompok perlakuan) dan n adalah jumlah ulangan perkelompok, maka jumlah n yang diharapkan (teoritis) adalah 5 (Federer, 1963). Sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebanyak 25 ekor yang dipilih dari hasil perbanyakan untuk keperluan penelitian. Persetujuan ethical clearance dari Komisi Etika Penelitian Kesehatan Wilayah Sumatera Utara Medan.
Bahan kimia. Bahan kimia yang dibutuhkan untuk meneliti efek pemberian vitamin C terhadap jumlah sperma dan morfologi sperma mencit jantan dewasa yang dipaparkan MSG adalah Monosodium glutamate murni, Vitamin C, NaCl 0,9%, Giemsa, Eosin-Y, Alkohol 70% (Merck) dan Aquadest.
3.4.2. Peralatan Utama Penelitian
Alat utama yang digunakan dalam penelitian antara lain: jarum oval (Gavage), bak bedah dan dissecting set, gelas arloji, cawan petri, batang pengaduk, timbangan (balance) dengan ketelitian 0,01 gram, objek glas, cover glass, spuit insulin 1 ml, kamar hitung Improved Neubauer dan mikroskop cahaya.
3.5. Disain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang didisain mengikuti Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini terdiri atas 5 kelompok perlakuan, yaitu:
a) Kelompok I (P0) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi larutan NaCl 0,9% sebanyak 0,5 ml secara intraperitoneal selama 30 hari. b) Kelompok II (P1) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG
4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9% secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari selanjutnya 15 hari berikutnya diberikan larutan NaCl 0,9% sebanyak 0,5 ml secara intraperitoneal setiap hari.
c) Kelompok III (P2) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9% secara intraperitoneal setiap hari selama 30 hari.
d) Kelompok IV (P3) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9%
secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari pertama, selanjutnya 15 hari berikutnya diberikan vitamin C 0,2 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml aquadest secara oral setiap hari.
e) Kelompok V (P4) = terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa yang diberi MSG 4 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml larutan NaCl 0,9% secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari pertama, selanjutnya 15 hari berikutnya pemberian MSG diteruskan disertai dengan pemberian vitamin C 0,2 mg/g berat badan yang dilarutkan dalam 0,5 ml aquadest secara oral setiap hari.
Mencit ditempatkan ke dalam kelompok secara random.
P4 P3 P2 P1 P0 0 15 30 (hari) Λαρυταν ΝαΧλ 0,9 % ΜΣΓ Λαρυταν ΝαΧλ 0,9% ΜΣΓ ΜΣΓ ςιταmιν Χ ΜΣΓ ΜΣΓ + ςιταmιν Χ ΜΣΓ Λαρυταν ΝαΧλ 0,9 %
3.6. Pelaksanaan Penelitian
3.6.1. Pemeliharaan Hewan Percobaan
Mencit ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik (ukuran 30x20x10 cm) yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang (pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00) dan 12 jam gelap (pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00), sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan (pelet komersial) dan minum (air PAM) disuplai setiap hari secara berlebih. Persetujuan ethical clearance dari Komisi Etika Penelitian Kesehatan Wilayah Sumatera Utara Medan.
3.6.2. Pengamatan
Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Selanjutnya dilakukan pengamatan sebagai berikut:
3.6.2.1.Pengambilan sekresi cauda epididimis
Untuk mendapatkan sperma di dalam sekresi cauda epididimis dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad (1983) sebagai berikut: Setelah 30 hari perlakuan, masing-masing hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Kemudian organ testis beserta epididimis sebelah kanan diambil dan diletakkan ke dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9%. Di bawah mikroskop bedah dengan pembesaran 400 kali cauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens. Selanjutnya cauda
epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9%, kemudian bagian proximal cauda dipotong sedikit dengan gunting lalu cauda ditekan dengan perlahan hingga sekresi cairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9%. Suspensi sperma dari cauda epididimis yang telah diperoleh dapat digunakan untuk pengamatan yang meliputi: jumlah sperma, dan morfologi sperma.
3.6.2.2.Pengamatan sperma
Pengamatan sperma dilakukan sebagai berikut:
Suspensi sperma yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan. Selanjutnya diambil sebanyak 10 ∝l sampel dan dimasukkan ke dalam kotak-kotak hemositometer Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca penutup. Di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, hemositometer diletakkan dan dihitung jumlah sperma pada kotak/bidang A,B,C,D, dan E. Hasil perhitungan jumlah sperma kemudian dimasukkan ke dalam rumus penentuan jumlah sperma/ml suspensi sekresi cauda epididimis sebagai berikut:
dimana N = jumlah sperma yang dihitung pada kotak A,B,C,D,dan E. ϑυmλαη σπερmα = Ν / 2 ξ 105 σπερmα/mλ
Gambar 3.1. Kamar Hitung Improved Neubauer (Zaneveld et al., 1986)
3.6.2.3.Morfologi sperma
Untuk menentukan morfologi sperma, diambil sperma dari cauda epididimis tersebut di atas dan dibuat sediaan hapus pada kaca objek, dikeringkan. Kemudian diberi alkohol 70% selama 15 menit, dikeringkan dan diberi perwarnaan Giemsa selama 15 menit. Setelah itu dibilas dengan air kran dan dikeringkan. Kemudian dengan mikroskop cahaya dihitung dengan jumlah 100 sperma, ditentukan persentasi sperma yang normal dan abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan cauda epididimis dijumlah kemudian diambil rata-ratanya. Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma abnormal mempunyai bentuk
kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan (amorphous), atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala (Gambar 3.2).
A B C D
Gambar 3.2. Morfologi Sperma Vas Deferen Mencit (Washington et al., 1983) Gambar A adalah Sperma Normal, dengan Kepala Seperti Kait Pancing, Gambar B, C dan D adalah Sperma Abnormal (B = Sperma dengan Kepala Seperti Pisang, C = Sperma Tidak Beraturan, dan D = Sperma Terlalu Bengkok)
3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis
Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± σιmπανγαν βακυ (ρατα- rata ± ΣD). Dιλακυκαν υϕι νορmαλιτασ δαν ηοmογενιτασ δατα. ϑικα δατα βερδιστριβυσι normal dan homogen maka dilakukan uji ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata
dilanjutkan dengan uji Post Hoc analisis Benferroni taraf 5% untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan masing-masing perlakuan.
Jika distribusi data tidak normal dan atau tidak homogen, maka dilakukan transformasi data. Kemudian diuji lagi normalitas dan homogenitas data. Apabila masih tidak normal distribusinya dan data tidak homogen maka diuji dengan uji Mann Whitney untuk membandingkan antara 2 kelompok perlakuan (kontrol vs perlakuan). Pada kelompok data lebih dari 2 kelompok maka dilakukan uji Friedman.
Semua analisa data dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 15,0. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada 〈 ≤ 0,05 ψανγ διανγγαπ βερmακνα
(signifikan).
3.8. Jadwal Penelitian
Keseluruhan kegiatan penelitian dari persiapan sampai pada penulisan hasil penelitian adalah lebih kurang tujuh minggu. Urutan kegiatan dan jadwal pelaksanaan secara lengkap dapat dilihat pada tabel berikut ini.
Tabel 3.1. Jadwal Penelitian No Kegiatan Minggu Ke 1 2 3 4 5 6 7 1 PERSIAPAN √ 2 PELAKSANAAN √ √ √ √ 3 ANALISA DATA √ 4 PENULISAN HASIL √
