METODE PENELITIAN
4.3 Metode Penelitian .1 Rancangan Penelitian .1Rancangan Penelitian
Pada penelitian ini dilakukan penelitian eksperimen laboratorium tentang uji kelarutan dan laju disolusi quercetin pada kelompok perlakuan dalam media dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05). Pembagian kelompok perlakuan ditunjukkan pada tabel IV.1. Terdapat dua variabel dalam penelitian ini, yaitu variabel terkontrol dan variabel tergantung. Untuk variabel terkontrolnya adalah adalah penambahan HPMC 3 cps dalam perbandingan jumlah yang berbeda pada dispersi padat quercetin – HPMC 3 cps, sedangkan untuk variabel
25 tergantungnya adalah kelarutan dan laju disolusi quercetin dalam masing – masing kelompok perlakuan.
Tabel IV.1 Pembagian Kelompok Perlakuan Quercetin
Bahan
Tanpa
Perlakuan Dengan Perlakuan Quercetin Murni (QC) Campuran Fisik (CF) Dispersi Padat (DP) I II III I II III Quercetin 1 1 1 1 1 1 1 HPMC 3cps - 1 2 3 1 2 3 Keterangan : QC : Quercetin Murni (1)
CF I : Campuran Fisik Quercetin – HPMC 3cps (1 : 1) CF II : Campuran Fisik Quercetin – HPMC 3cps (1 : 2) CF III : Campuran Fisik Quercetin – HPMC 3cps (1 : 3) DP I : Dispersi Padat Quercetin – HPMC 3cps (1 : 1) DP II : Dispersi Padat Quercetin – HPMC 3cps (1 : 2) DP III : Dispersi Padat Quercetin – HPMC 3cps (1 : 3)
Dari masing – masing kelompok perlakuan yaitu dispersi padat, campuran fisik dan quercetin murni ditambahkan dalam 40 mL dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) pada bejana kelarutan. Kemudian diaduk menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan tertentu pada suhu 30 ± 0,5 oC. Diambil cuplikan larutan pada waktu yang telah ditentukan, kemudian didiamkan selama 5 menit, disaring dan diukur absorbannya dengan spektrometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimum quercetin. Untuk uji disolusi, campuran fisik dan quercetin murni dimasukkan ke dalam bejana disolusi. Kemudian masing – masing perlakuan dilakukan uji disolusi sebanyak tiga kali dalam media disolusi dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) pada suhu 37 ± 0,5oC sebanyak 900 mL, menggunakan pengaduk tipe I (basket) dengan kecepatan 100 rpm.
Untuk membandingkan laju disolusi quercetin antar kelompok perlakuan, maka dibuat profil disolusi quercetin kemudian ditentukan harga efisiensi disolusi (ED30). Bagan mengenai rancangan penelitian dapat dilihat pada gambar 4.1.
27 4.3.2 Kerangka Penelitian
Gambar 4.1 Bagan perencanaan penelitian ADLN_Perpustakaan Universitas Airlangga
4.3.3 Pemeriksaan Bahan Baku Penelitian 4.3.3.1 Pemeriksaan Quercetin
a. Analisis Spektrofotometri Inframerah
Spektrum inframerah quercetin dibuat dengan metode cakram KBr. Sebanyak 2 mg quercetin dalam KBr digerus sampai homogen dalam mortir, kemudian dimasukkan ke dalam pengering hampa udara, selanjutnya dicetak dengan penekan hidrolik sampai diperoleh cakram yang transparan. Cakram yang terbentuk dimasukkan dalam kuvet dan dialiri sinar inframerah, kemudian diamati spektrumnya. Hasil pemeriksaan dibandingkan dengan spektrum inframerah quercetin standar.
b. Analisis Termal dengan DTA (Differential Thermal Analysis) Pemeriksaan titik lebur quercetin dengan menggunakan DTA, yaitu dengan menimbang quercetin 3 – 5 mg dalam krus aluminium. Selanjutnya krus aluminium dimasukkan ke dalam alat DTA yang diatur dengan kecepatan pemanasan 10oC/menit dan pengamatan dilakukan pada rentang suhu 200 - 350oC. Pemeriksaan ini dimaksudkan untuk membandingkan titik lebur quercetin sesuai dengan pustaka yaitu sebesar 314oC.
4.3.3.2 Pemeriksaan HPMC 3 cps a. Analisis Spektrofotometri Inframerah
Spektrum Inframerah HPMC 3cps dibuat dengan metode pellet KBr seperti pada prosedur 4.3.3.1
29 b. Analisis Termal dengan DTA (Differential Thermal Analysis)
Pemeriksaan titik lebur HPMC 3cps menggunakan DTA seperti pada prosedur 4.3.3.1 dilakukan pada rentang suhu 100 - 200oC untuk membandingkan titik lebur HPMC 3 cps dengan pustaka yaitu 160oC.
4.3.4 Pembuatan Kurva Baku Quercetin
4.3.4.1 Pembuatan Larutan Baku Induk Quercetin
Larutan baku induk quercetin dibuat dengan kadar 400 µg/mL. Larutan baku tersebut dibuat dengan menimbang teliti sebanyak 20,0 mg quercetin dan dilarutkan etanol p.a. Kemudian larutan tersebut ditambahkan etanol p.a dalam labu ukur 50,0 mL sampai tepat tanda.
4.3.4.2 Pembuatan Larutan Baku Kerja Quercetin
Larutan baku kerja quercetin dibuat dengan konsentrasi 0,4; 4; 8; 16; 20 dan 24 µg/mL dengan cara berikut : a. Dipipet sebanyak 0,5 mL larutan baku induk,
dimasukkan ke dalam labu ukur 500,0 mL kemudian ditambahkan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai tepat tanda sehingga diperoleh konsentrasi 0,4 µg/mL.
b. Dipipet sebanyak 0,5 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL kemudian ditambahkan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai tepat tanda sehingga diperoleh konsentrasi 4 µg/mL.
c. Dipipet sebanyak 0,5 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL kemudian ditambahkan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai tepat tanda sehingga diperoleh konsentrasi 8 µg/mL.
d. Dipipet sebanyak 1,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL kemudian ditambahkan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai tepat tanda sehingga diperoleh konsentrasi 16 µg/mL.
e. Dipipet sebanyak 0,5 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian ditambahkan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai tepat tanda sehingga diperoleh konsentrasi 20 µg/mL.
f. Dipipet sebanyak 3,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL kemudian ditambahkan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai tepat tanda sehingga diperoleh konsentrasi 24 µg/mL.
4.3.4.3 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Quercetin Panjang gelombang maksimum quercetin ditentukan dengan menggunakan larutan baku kerja quercetin kadar 8 dan 16 µg/mL. Larutan baku tersebut diamati absorbannya dengan spektrofotometer UV – Vis pada panjang gelombang 200 – 500 nm. Panjang gelombang maksimum yang ditentukan merupakan panjang gelombang yang memberikan absorban terbesar.
31 Panjang gelombang maksimum teoritis dari quercetin : 258 dan 375 nm.
4.3.4.4 Pembuatan Kurva Regresi Quercetin
Larutan baku quercetin yang telah dibuat diamati absorbannya pada panjang gelombang maksimum quercetin, kemudian dibuat kurva absorban terhadap kadar larutan baku quercetin. Selanjutnya akan diperoleh suatu persamaan kurva baku dari hasil regresi linier kurva tersebut.
4.3.4.5 Pemeriksaan Pengaruh HPMC 3 cps Terhadap Pemeriksaan Kadar Quercetin
Dibuat larutan HPMC 3cps dalam air suling dengan kadar 200 µg/mL. Larutan HPMC dipipet 1,0 mL kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL. Kemudian ditambahkan 1,0 mL larutan baku induk quercetin 200 µg/mL, kemudian campur larutan tersebut dan diencerkan dengan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai 25,0 mL sehingga didapatkan larutan campuran quercetin dan HPMC 3 cps dengan perbandingan 1:1. Kemudian larutan tersebut diamati absorbannya menggunakan spektrofotometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimal. Spektrum yang dihasilkan dibandingkan dengan spektrum larutan baku kerja quercetin kadar 8 µg/mL.
4.3.5 Pembuatan Campuran Fisik Quercetin – HPMC 3cps Campuran fisik quercetin – HPMC 3cps dibuat dengan terlebih dahulu mengayak masing – masing bahan (quercetin maupun HPMC 3cps) dengan pengayak mesh no. 50. Timbang teliti quercetin dan HPMC 3cps sesuai
dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3 (b/b) seperti yang direncanakan pada tabel IV.1. Setelah itu, tambahkan quercetin pada HMPC 3cps dan campur hingga homogen. 4.3.6 Pembuatan Dispersi Padat Quercetin – HPMC 3 cps
Pembuatan dispersi padat dilakukan dengan metode pelarutan, yaitu dengan menimbang teliti sejumlah bahan setara dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3 (b/b) yang direncanakan pada tabel IV.1. HPMC 3 cps dilarutkan dengan menggunakan air suling sedangkan quercetin dilarutkan dengan etanol p.a. Kemudian ke dalam larutan HPMC 3cps tersebut ditambahkan larutan quercetin sedikit demi sedikit. Campuran quercetin –
HPMC 3 cps tersebut kemudian diaduk dengan menggunakan magnetik stirrer hingga terbentuk sistem dispersi padat. Setelah itu dispersi padat quercetin –
HPMC 3cps diuapkan pelarutnya hingga kering. Massa digerus dalam mortir agat, kemudian diayak dengan ayakan mesh no. 50.
4.3.7 Pemeriksaan Homogenitas Quercetin
Pada masing – masing kelompok campuran fisik dan dispersi padat, diambil sejumlah sampel setara 20 mg quercetin dan dilarutkan dengan etanol p.a sampai 10,0 mL. Larutan tersebut dipipet 1,0 mL dan diencerkan dengan dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sampai 25,0 mL. Absorban sampel diamati dengan spektrofotometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimum quercetin dan dihitung % perolehan kembali kadar quercetin.
33 4.3.8 Pengujian Kelarutan Quercetin
4.3.8.1 Pengamatan Waktu Kelarutan Jenuh Quercetin Untuk menentukan waktu tercapainya larutan jenuh quercetin dalam media dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) dilakukan prosedur sebagai berikut :
Ditimbang sejumlah 20 mg quercetin dan ditambahkan dalam 40 mL dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) pada bejana kelarutan. Kemudian diaduk menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan tertentu pada suhu 30 ± 0,5 oC. Diambil cuplikan larutan pada 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360 dan 420 menit, kemudian didiamkan selama 5 menit, disaring dengan kertas saring millipore 0,45µm dan diukur absorban dengan spektrometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimum quercetin.
4.3.8.2 Pengamatan Uji Kelarutan Quercetin
Untuk menentukan tercapainya kelarutan dispersi padat quercetin – HPMC 3 cps dalam air, dilakukan prosedur sebagai berikut :
Ditimbang sampel setara 20 mg quercetin kemudian ditambahkan dalam 40 mL dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) pada bejana kelarutan. Kemudian diaduk menggunakan magnetik stirrer dengan kecepatan tertentu pada suhu 30 ± 0,5 oC. Diambil cuplikan larutan pada waktu yang sudah ditentukan sesuai dengan waktu kelarutan jenuh quercetin, didiamkan selama 5 menit, disaring dengan kertas saring millipore 0,45µm dan
diukur absorban dengan spektrometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimum quercetin.
4.3.9 Uji Disolusi Quercetin
Preparasi uji disolusi dilakukan dengan cara menimbang sampel 20 mg serbuk quercetin, serta campuran fisik dan dispersi padat quercetin – HPMC 3cps yang setara dengan 20 mg quercetin. Masing – masing sampel tersebut kemudian dimasukkan ke dalam bejana disolusi.
Uji disolusi dilakukan terhadap 20 mg serbuk quercetin murni, campuran fisik dan dispersi padat quercetin – HPMC 3 cps yang setara dengan 20 mg quercetin. Alat uji disolusi yang digunakan adalah pengaduk bentuk basket (tipe I, keranjang) dengan kecepatan 100 rpm serta dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Media disolusi yang digunakan adalah dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05) sebanyak 900 mL. Prosedur uji disolusinya adalah sebagai berikut :
Bejana disolusi diisi dengan sebanyak 900 mL dapar sitrat - NaOH (pH 5,0 ± 0,05; diuji dengan pHmeter) dan termostat diatur pada suhu 37 ± 0,5oC. Setelah suhu media disolusi mencapai 37 ± 0,5oC, sampel yang telah disiapkan, dimasukkan ke dalam bejana disolusi dan pengaduk diputar dengan kecepatan 100 rpm. Cuplikan sampel diambil sebanyak 5,0 mL setiap interval waktu 5, 10, 15, 30, 45, 60 menit, kemudian disaring menggunakan kertas saring milipore 0,45 µm. Pada setiap pengambilan cuplikan sampel dilakukan penggantian
35 media disolusi air suling sejumlah 5,0 mL. Setelah itu, masing – masing cuplikan sampel diamati absorbannya pada spektrofotometer UV – Vis pada panjang gelombang maksimum quercetin. Kadar quercetin yang terlarut tiap interval waktu dapat diperoleh dengan memasukkan harga absorban sampel ke persamaan kurva baku quercetin (Kakran, 2011).
Untuk mendapatkan kadar yang sebenarnya dengan memperhitungkan pengenceran 5,0 mL media disolusi dalam setiap pengambilan cuplikan sampel, maka digunakan faktor koreksi dalam persamaan Wurster sebagai berikut (Wurster & Taylor, 1965) :
∑
...(4)
Keterangan :
Cn : Kadar sebenarnya setelah koreksi (mg/L)
C’n : Kadar yang terukur oleh spektrofotometer (mg/L) Cs : Kadar yang terukur spektrofotometer dari sampel yang
sebelumnya (mg/L)
a : Volume sampel yang diambil (mL) b : Volume media disolusi (mL)
4.3.10 Evaluasi Data 4.3.10.1 Evaluasi Kelarutan
Perhitungan kelarutan dihitung berdasarkan persentase kelarutannya (% b/v). Sehingga dapat diketahui bahwa kelarutan pada masing – masing perlakuan memiliki perubahan yang bermakna atau tidak dengan uji statistik.
4.3.10.2 Evaluasi Profil Disolusi
Penentuan kurva profil disolusi merupakan kurva yang menggambarkan jumlah senyawa yang terlarut terhadap waktu.
4.3.10.3 Perhitungan Harga Efisiensi Disolusi (ED)
Perhitungan menggunakan rumus II.4 untuk membandingkan laju disolusi quercetin antar kelompok perlakuan pada menit tertentu. Harga efisiensi disolusi yang akan dibandingkan antar perlakuan adalah ED30. 4.3.10.4 Analisis Statistika
Untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang bermakna pada kelarutan jenuh quercetin pada waktu sampling, maka dilakukan uji statistik unpaired t-test, dan untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang bermakna pada kelarutan quercetin pada masing – masing perlakuan maka dilakukan uji statistik dengan one – way ANOVA
(Analysis of Variance). Sedangkan untuk membandingkan
laju disolusi quercetin antar kelompok perlakuan dapat dilakukan perhitungan ED30. Data kemudian dianalisis secara statistik dengan ANOVA (Analysis of Variance). Untuk menunjukkan adanya kebermaknaan perbedaan antar kelompok perlakuan dengan derajat kepercayaan
37
0,95 (α = 0,05) dengan membandingkan harga F hitung
dengan F tabel. Jika nilai F hitung lebih besar dari F tabel maka terdapat perbedaan efisiensi disolusi yang bermakna, minimal satu pasang data.
Bila ada perbedaan efisiensi disolusi quercetin yang bermakna, maka untuk mengetahui letak perbedaannya dilanjutkan uji HSD (Honestly Significant Difference) menurut Tukey dengan α = 0,05.
√ ...(5) Keterangan :
q : diperoleh dari tabel F
α : derajat kepercayaan k : jumlah perlakuan N : jumlah pengamatan total n : jumlah pengulangan MSE : kuadrat rata – rata kesalahan
Jika selisih rata – rata efisiensi disolusi antara dua perlakuan lebih besar dari hasil perhitungan nilai HSD, maka terdapat perbedaan efisiensi disolusi yang bermakna antara dua perlakuan tersebut.
BAB V