Pengambilan contoh daun dilakukan pada populasi S. leprosula di 13 lokasi di Indonesia (Tabel 1). Penelitian elektroforesis dan analisis DNA dilakukan di Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Juni 2005 untuk pengambilan data primer selanjutnya bulan Juli-September 2005 untuk studi pustaka dan analisis data.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini berupa daun S. leprosula yang telah kering. Selain itu juga digunakan silika gel, nitrogen cair, bahan-bahan kimia untuk membuat buffer untuk proses ekstraksi DNA, PCR, dan pemotongan DNA, agaros, serta ethidium bromida (EtBr).
Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan contoh di lapangan meliputi:
tally sheet, label, alat tulis, plastik klip, gunting. Alat-alat yang digunakan untuk elektroforesis dan analisis DNA di laboratorium meliputi: mortar dan pestel, sarung tangan, pipet, pipet mikro, sentrifugasi, vortex, spatula, gelas piala, gelas ukur, koleksi tabung, cetakan gel, bak elektroforesis, tray, microwave, power supply, pH meter, gelas piala, gelas ukur, timbangan analitik, pengaduk magnet, lemari pendingin, water bath, mesin PCR, ultraviolet transiluminator, kamera digital.
Prosedur Penelitian Optimasi metode
Tahapan optimasi metode dilakukan untuk menjamin munculnya pita dengan resolusi yang tinggi. Tahapan optimasi metode ini meliputi 3 proses utama, yaitu ekstraksi DNA, amplifikasi PCR dan pemotongan cpDNA. Optimasi ekstraksi DNA dari daun dimulai dari penentuan ukuran daun yang diekstrak, komposisi bahan ekstraksi, suhu dan kepekatan gel agaros pada proses elektroforesis, termasuk pengenceran DNA hasil ekstraksi. Optimasi pada proses
cpDNA serta primer yang akan digunakan, pengaturan suhu pada thermocycler
sesuai dengan primer yang digunakan, suhu dan kepekatan gel agaros pada proses elektroforesis. Optimasi pada proses pemotongan DNA yang dilakukan adalah mencari komposisi bahan yang digunakan untuk pemotongan DNA serta mencari jenis enzim restriksi yang akan digunakan, kondisi arus, tegangan dan persentase agaros pada elektroforesis. Skema prosedur penelitian menggunakann penanda PCR-RFLP dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Bagan alur penelitian di laboratorium
Pengambilan Contoh
Pengambilan contoh dilakukan di 13 populasi S. leprosula (Tabel 1), dimana pada masing- masing populasi diambil 5 contoh (Gambar 6). Pengambilan contoh daun dilakukan dengan mengambil daun ke 2 atau ke 3 dari pucuk dengan jumlah sekitar 5 daun yang berada di lokasi dan dimasukkan ke dalam plastik klip, kemudian dalam plastik tersebut dimasukkan silika geldengan perbandingan berat daun contoh dan silika gelsebesar 1 : 5. Silika gel yang sudah berubah warna diganti dengan silika gel yang baru sampai contoh daun menjadi kering. Pada plastik klip diberi label yang meliputi: nomor pohon diameter, tinggi pohon dan
Ekstraksi DNA
Ya Tidak
PCR
Ya Tidak
lokasi. Selain itu juga dilakukan pengambilan daun yang digunakan untuk herbarium untuk keperluan identifikasi jenis.
Tabel 1. Lokasi pengambilam contoh S. leprosula
Perkiraan Lokasi No
Batch Lokasi Provinsi Garis Bujur Garis Lintang
1 Haurbentes, Bogor Jawa Barat 106041’ - 107042’ BT 6054’-7054’ LU 2 Tering Kalimantan Timur 115022’ – 116038’ BT 000 – 00010’ LS 3 Asialog, Jambi Sumatra 103015’ – 103033’ BT 2002’ – 2022’ LU 4 Pasir Mayang, Jambi Sumatra 101019’ – 103020’ BT 0008’ – 0309’ LU 5 TNBT, Riau Sumatra 102013’ – 103014’ BT 0105’ - 0206’ LU 6 Nanjak Makmur, Jambi Sumatra 101040’ BT 10022’ LU 7 Sari Bumi Kusuma Kalimantan Selatan 111018’ - 114042’ BT 01059’ - 00036’ LU 8 PT ITCI Kartika Utama Kalimantan Timur 116017’ - 11706’ BT 00020’ - 01018’ LU 9 Kebun Percobaan Darmaga,
Bogor
Jawa Barat 106050’ – 1070 50’ BT 6036’ – 7040’ LU 10 Bukit Bangkirai, Balikpapan Kalimantan Timur 117032’ – 118035’ BT 00014’ – 01015’ LU 11 Sumalindo, Samarinda Kalimantan Timur 115018’ – 116036’ BT 00055’ – 00056’ LS 12 Carita I Banten 105°15' – 106011’ BT 6°21' - 7°10' LU 13 Carita II Banten 105°15' – 106011’ BT 6°21' - 7°10' LU 810 11 7 6 3 12 1 9 2 4 5 4
Ekstraksi DNA
Metode yang digunakan untuk ekstraksi DNA mengikuti prosedur yang dikeluarkan oleh QIAGEN dengan menggunakan DNeasy Plant Mini Kit untuk isolasi jaringan tanaman. Ekstraksi DNA ini meliputi tiga tahapan, yaitu tahapan prespitasi, pencucian dan elusi (Lampiran 1).
Tahap pertama yaitu tahapan prespitasi dimulai dengan menggerus contoh daun meranti berukuran 2 x 1 cm yang ditambahkan nitrogen cair dengan menggunakan mortar dan pestel untuk mendapatkan serbuk. Serbuk kemudian dipindahkan ke dalam tabung yang berkuran 2 ml. Tambahkan 400 µl buffer AP1 dan 4 µl RNAse A (100 mg/ml) yang berfungsi untuk menghilangkan RNA dalam larutan. Larutan tersebut kemudian di kocok dengan menggunakan vortex.
Larutan diinkubasi di dalam water bath selama 10 menit dengan suhu 65oC, kemudian dikocok 2 - 3 kali selama inkubasi dengan membalikkan tabung. Ditambahkan 130 µl buffer AP2, vortex, kemudian diinkubasikan ke dalam es selama 5 menit, kemudian di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan penuh. dimasukkan cairan ke dalam QIAShedder spin column yang terdapat pada koleksi tabung 2 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 2 menit denga n kecepatan maksimum. Larutan yang mengalir lewat fraksi dari dipindahkan ke tabung yang baru (tanpa penambahan). 1,5 volume buffer AP3/E (buffer sebelumnya ditambahkan dengan etanol) pada larutan bersih ditambahkan dan dicampur dengan pemipetan. dimasukkan 650 µl larutan ke DNeasy mini spin column yang di letakkan di koleksi tabung 2 ml, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm kemudian cairan yang melewati fraksi dibuang.
Tahapan kedua yaitu tahapan pencucian (washing) dimulai dengan menempatkan DNeasy column pada tabung koleksi 2 ml yang baru , kemudian ditambahkan 500 µl buffer AW pada DNeasy column dan sentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 8000 rpm. Cairan yang melewati fraksi dibuang, kegiatan ini dilakukan dua kali, kemudian disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan maksimal.
Tahapan ketiga yaitu tahapan elution dilakukan dengan menyimpan
DNeasy column pada 1,5 atau 2 ml tabung sentrifugasi dan pipet 100 µl buffer AE hangat (65oC) ke dalam membran Dneasy dan dilakukan inkubasikan selama 5 menit pada suhu ruangan, kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm, tahapan ini dilakukan dua kali, sehingga akan dihasilkan DNA hasil ekstraksi sebanyak 200 µl.
DNA hasil ekstraksi kemudian dilakukan uji kualitas dengan menggunakan teknik elektroforesis agaros 1%. Gel ini dibuat dengan melarutkan agaros sebanyak 2,5 µl ke dalam 250 µl larutan TAE (tris acetate with EDTA). Kemudian larutan dipanaskan di dalam microwave sampai mendidih. Larutan gel dibiarkan sampai hangat (± 50oC) kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel dengan ketebalan 5 mm. Cetakan gel tersebut telah dipasang sisir/comb yang berfungsi untuk membuat cetakan sumur gel/well elektroforesis. Gel didinginkan sampai membeku. Kemudian sisir/comb dicabut dan gel beserta cetakannya dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer elektroforesis yaitu
buffer TAE sebanyak 2300 ml. DNA hasil ekstraksi sebanyak 15 µl ditambah 3,75 µl bahan pewarna (blue juice) dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. Setelah itu bak elektroforesis ditutup dan dialiri listrik dengan tegangan 25 volt selama 3 jam.
Gel yang sudah dielektroforesis dilakukan pewarnaan dengan merendamkan gel di dalam larutan ethidium bromida (EtBr) 25 µl dan aquadest 500 ml selama 1 jam. Kemudian dideteksi dengan mengunakan ultraviolet transiluminator.
Amplifikasi PCR
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR MJ Reseach PTC-100 Peltier Thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer universal (hampir terdapat di semua tumbuhan) yaitu petB, psaA, psbA, rbcL dan
Gambar 7. Letak petB, psaA, trnLF dan rbcL pada peta plasmid cpDNA Nicotiana tabacum
Urutan nukleotida dari masing- masing primer adalah sebagai berikut :
petB : 5’-TGGGGAACTACTCCTTTGAT-3’ 5’-CCCGAAATACCTTGCTTACG-3’ psaA : 5’-AAGAATGCCCATGTTGTGGC-3’ 5’-TTCGTTCGCCGGAACCAGAA-3’ rbcL : 5’-TGTCACCAAAAACAGAGACT-3’ 5’-TTCCATACTTCACAAGCAGC-3’ trnLF : 5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ 5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’
Primer yang akan digunakan sebelumnya dilakukan pengenceran terlebih dahulu. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil primer pekat dengan konsentrasi 50 µM sebanyak 20 µl kemudian ditambahkan H2O sebanyak 180 µl. Konsentrasi akhir primer akan menjadi 5 µM. Komposisi bahan-bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi ini tersaji pada tabel 2.
Tabel 2. Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR
Komponen Volume
Template DNA 2,0 µl
Forward primer (5 pM) 1,8 µl
Reverse primer (5 pM) 1,8 µl
Destilled water 1,9 µl
HotStar Taq® Master Mix Kit (Qiagen, Hilden) 7,5 µl
Lautan PCR untuk setiap contoh merupakan campuran dari dari berbagai komponen seperti pada Tabel 2. kemudian ditambahkan 1,9 µl destilled water
hingga volume larutan mencapai 15 µl. Larutan kemudian diaduk dengan menggunakan vortex kemudian disentrifugasi. Larutan tersebut kemudian di masukan kedalam mesin PCR yang sudah di program dengan pengkondisian suhu dan waktu. Seperti pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengkondisian suhu dan waktu pada mesin PCR untuk primer petB, psaA, trnLFdan rbcL Tahapan Suhu (o C) Waktu (menit) Jumlah siklus Pemanasan Awal - Denaturasi - Annealing - Extension Pemanasan akhir Penyimpanan 95 94 50 & 56 72 72 8 15 1 1 2 10 Selamanya 1 35 1 1
Hasil PCR kemudian di uji dengan menggunakan gel agaros dengan kepekatan 2%, yang dibuat dengan melarutkan 0,4 mg agaros dalam 40 ml TAE. Larutan hasil PCR sebanyak 3 µl dicampurkan dengan larutan pewarna (brom phenol) sebanyak 3 µl dimasukkan ke dalam sumur gel. Larutan tersebut
sedikit atau sama dengan hasil ekstraksi maka harus dilakukan PCR ulang dengan komposisi DNA yang lebih encer. Pengenceran ini dilakukan karena sifat DNA dari Meranti memiliki kadar fenol yang tinggi. Kadar fenol yang tinggi ini dapat menghambat daya kerja primer.
Analisis PCR - RFLP
Analisis polimorfik dilakukan dengan teknik PCR-RFLP untuk melihat jumlah basa antar fragmen. DNA kloroplas hasil PCR dipotong dengan menggunakan enzim restriksi untuk analisis keragaman genetik. Dibawah ini adalah jenis-jenis enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini.
Tabel 4. Jenis enzim restrksi yang digunakan utuk memotong DNA
No Nama Sumber Situs
pemotongan
Temperatur Inkubasi (oC)
1 Alu I Anthrobacter loteus AG↓CT
TC↑GA 37
2 Taq I Thermus aquticus T↓CGA
AGC↑T 65
3 Hinf I Haemophilus influenzae G↓ANTC
CTNA↑G 37 4 Rsa I Rhodopseudomonas
sphaeroides
GT↓AC
CA↑TG 37
5 Cfo I Clostridium formicoaceticum GCG↓C
C↑GCG 37
6 Msp I Moraxella sp. C↓CGG
GGC↑C 37
7 Dra I Deinococcus radiopilus TTT↓AAA
AAA↑TTT 37 8 BamH I Bacillus amyloliquefaciens H. C↓GATC
CTAG↑G 37 9 Hind III Haemophilus influenzae A↓AGCT
TCGA↑G 37 10 Pst I Providensia stuartii TGCA↓G
G↑ACGT 37
Larutan yang digunakan untuk pemotongan ini adalah 0,5 µl enzim restriksi, 1µl bufer, 5µl bidest steril, 5 µl DNA hasil PCR. Larutan ini kemudian diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 370C selama 1 jam. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi kemudian diuji dengan elektroforesis agaros dengan kepekatan 3%, artinya 0,8 gr dalam 40 µl TAE. Elektroforesis dilakukan dengan
tegangan 100 volt selama 45 menit untuk memastikan fragmen DNA terpisah dengan sempurna. Hasil pemotongan ini kemudian dideteksi dengan menggunakan ultraviolet transiluminator dan difoto dengan menggunakan kamera digital untuk dinalisis dikomputer.
Uji polimorfisme
Pengujian polimorfisme dilakukan dengan menggunakan teknik PCR-RFLP. Pengujian ini dilakukan untuk mencari variasi DNA kloroplas pada S. leprosula yang didasarkan pada pola pemotongan pita yang dihasilkan dari penggunaan beberapa kombinasi perlakuan. Komb inasi perlakuan yang diuji dalam penelitian ini menggunakan 4 macam primer dan 10 macam enzim restriksi.
Hasil pengujian pada cpDNA dikatakan polimorfik apabila mempunyai pola pita yang dihasilkan mempunyai sekurang-kurangnya lebih dari satu variasi, Sedangkan cpDNA dikatakan monomorfik jika tidak memperlihatkan adanya variasi pada pemotongan pola pita. Selanjutnya, untuk kombinasi perlakuan yang memberikan hasil polimorfik dilakukan analisis lebih lanjut untuk melihat variasi genetik pada level inter dan intra populasi, sekaligus untuk melihat kekerabatannya.
Analisis Data
Data analisis hasil elektroforesis yaitu situs restriksi yang berupa pola pita DNA yang digunakan untuk menghitung haplotipe. Pola pita yang muncul (positif) diberi nilai 1 (satu) dan pola pita yang tidak muncul (negatif) diberi nilai 0 (nol). Hasil perhitungan kemudian dianalisis untuk mengetahui frekuensi dan keragaman haplotype dalam jenis dan antar populasi S. leprosula dengan menggunakan sofware ARLEQUIN Ver 2.000 (Schneider et al 2000), untuk mengetahui jarak genetik antar populasi sofware GSED ver 1.1 (Gillet, 2002). Situs restriksi digunakan juga untuk melihat kemiripan (similiarity) antar haplotipe serta untuk melihat dendogram dengan menggunakan metoda UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Averaging) dengan sofware NTSYS Ver 2.0 (Rohlf 1998).