METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Rancangan Penelitian
Metode yang digunakan adalah metode eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian sederhana (post test only control group design) yang meliputi pengumpulan bahan, identifikasi sampel, pembuatan ekstrak, dan uji toksisitas. Penelitian dilakukan di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Maret 2014. Bagan kerja penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 2, 3, dan 4, halaman 47-50.
3.2Variabel Penelitian
Variabel-variabel dalam penelitian ini adalah:
a. Variabel bebas : Konsentrasi dari ekstrak tinta cumi-cumi. b. Variabel terikat : Persentase kematian larva Artemia salina
Leach c. Variabel terkontrol :
1. Faktor hewan uji yaitu larva Artemia Salina Leachberumur 48 jam
2. Faktor lingkungan percobaan, yaitu sinar lampu 5 watt, suhu penetasan, yaitu 25o - 30o C, pH air laut buatan, yaitu 8-9, dan kadar garam 5 permil.
3.3 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat alat gelas laboratorium (Pyrex), Mat pipet ketelitian 0,1 ml dan 0,02 ml (Pyrex), termometer, oven listrik (Stork), hair dryer (Maspion), neraca analitik (Vibra
25
AJ), neraca kasar (Saherand), penangas air (Yenaco), flakon, aquarium khusus BSLT, lampu penerang 5 watt (Hannochs), dan seperangkat alat destilasi.
3.4Bahan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tinta dari cumi- cumi jenis Photololigo duvaucelii di mana hewan cumi-cumi berasal dari pusat Pasar Tradisional Sambu Kota Medan. Bahan yang digunakan untuk penyarian yaitu berupa pereaksi n-heksan, etilasetat, dan etanol 96% berkualitas teknis yang telah dimurnikan dengan cara destilasi. Bahan yang digunakan untuk uji BSLT antara lain telur Artemia salina Leach (Brine Shrimp Egg, Ocean Star International Inc), air laut buatan berkadar garam 5 per mil, ekstrak n-Heksan, ekstrak etilasetat, dan ekstrak etanol tinta cumi- cumi (Photololigo duvaucelii), dan suspensi ragi Saccharomyces cerevisae. Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berupa aquades dan garam air laut yang mengandung natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalsium klorida, kalium klorida, dan natrium bikarbonat.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Penyiapan sampel
Penyiapan sampel dlakukan secara purposif (sengaja) yaitu tanpa membandingkan dengan hewan yang sama dari daerah lain yaitu cumi-cumi jenis Photololigo duvaucelii yang diperoleh dari salah satu kios perikanan di pusat pasar Sambu Kota Medan, provinsi Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi hewan
26
Indonesia Pusat Penelitian Oseanografi di Jakarta. Hasil identifikasi hewan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 46.
3.5.3 Preparasi sampel tinta cumi-cumi
Cumi-cumi segar sebanyak 6 kg diambil kantung tintanya dengan pinset anatomi lalu dibedah untuk mengeluarkan tintanya. Tinta ditampung dalam wadah beaker glass dan disimpan dalam lemari pendingin sebelum digunakan.
3.5.4 Ekstraksi berkesinambungan tinta cumi-cumi 3.5.4.1 Pembuatan ekstrak n-heksan
Tinta Cumi-cumi diukur volumenya dengan gelas ukur kemudian dimasukkan dalam wadah beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut n-heksan dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut menggunakan batang pengaduk dan disimpan selama 7 hari di dalam lemari pendingin. Masing-masing ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1 dan dipekatkan pada suhu 40oC di atas penangas air. Ekstrak dikumpulkan dan ditimbang beratnya (Girija, 2012).
3.5.4.2 Pembuatan ekstrak etilasetat
Sisa tinta dari ekstraksi pertama dibebaskan dari n-heksan dengan cara dikeringanginkan dengan hair dryer kemudian diukur kembali volumenya dengan gelas ukur, dimasukkan ke dalam beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut etilasetat dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut menggunakan batang pengaduk dan disimpan dalam lemari pendingin selama 7 hari. Ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1, dipekatkan pada suhu 40o di atas penangas air, dikumpulkan dan ditimbang beratnya (Girija, 2012).
27
3.5.4.3 Pembuatan ekstrak etanol
Sisa tinta dari ekstraksi kedua dibebaskan dari etilasetat dengan cara dikeringanginkan dengan hair dryer kemudian diukur kembali volumenya dengan gelas ukur, dimasukkan ke dalam beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut etanol dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut menggunakan batang pengaduk dan disimpan dalam lemari pendingin selama 7 hari. Ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1 dan dipekatkan pada suhu 40oC di atas penangas air. Ekstrak dikumpulkan dan ditimbang beratnya (Girija, 2012).
3.5.5 Uji kualitatif senyawa steroid/triterpenoid
Tinta cumi-cumi ditambah setetes asam asetat anhidrida dengan setetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna biru, hijau, atau merah menandakan adanya steroid/ triterpenoid. Ekstrak tinta cumi-cumi diambil cupikannya masing- masing sebanyak tiga tetes untuk diujikan dengan pereaksi lieberman burchard.
3.5.6 Uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
3.5.6.1 Pembuatan air laut buatan
Air laut buatan berkadar garam 5 per mil dan pH antara 7,3 - 8,4 merupakan media hidup yang sesuai untuk larva Artemia salina Leach. Bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berkadar garam 5 per mil yaitu 10 gram garam air laut yang terdiri dari 5 g natrium klorida, 1,3 g magnesium sulfat, 1 g magnesium klorida, 0,3 g kalsium klorida, 0,2 g kalium klorida, dan 2 g natrium bikarbonat dicampur dalam 1 liter aquadest. Bahan untuk pembuatan air laut buatan dapat diracik secara manual atau langsung menggunakan garam air
28
laut yang telah jadi ada tersedia dipasaran. Bahan-bahan tersebut ditimbang lalu dilarutkan dalam sebagian aquadest pada labu takar 1 liter kemudian ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter. (Mudjiman, 1989).
Tabel 3.1 Bahan untuk pembuatan air laut buatan
No Bahan Jumlah (g) 1. NaCl 5,0 2. MgSO4 1,3 3. MgCl2 1,0 4. CaCl2 0,3 5. KCl 0,2 6. NaHCO3 2,0
7. Aquadest Sampai 1 liter
3.5.6.2 Penetasan telur Artemia salina Leach
Tempat penetasan telur artemia berupa aquarium dengan kaca gelap yang terbagi menjadi dua bagian dengan suatu sekat berlubang pada bagian bawahnya. Salah satu bagian adalah area yang terang, sedangkan bagian lain adalah area yang gelap tempat telur artemia ditaburkan. Suhu penetasan berkisar antara 25oC-30oC, pH antara 7,3 - 8,4. Air laut buatan dengan kadar garam 5 per mil diaerasi selama 1 jam. Air laut buatan dimasukan dalam aquarium khusus BSLT. Siste artemia ditaburkan di area gelap secara merata dan diberi penerangan., Siste akan menetas setelah 24 jam menjadi nauplius yang aktif bergerak menuju ke tempat terang. Larva yang akan digunakan adalah larva yang telah berumur 48 jam.
Siste artemia yang telah menetas harus ditambahkan lagi air laut buatan yang telah diaerasi selama 1 jam agar larva artemia yang baru menetas tidak kekurangan oksigen.
29
Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml dibuat dengan menimbang 100,0 mg ekstrak n-heksan tinta cumi-cumi kemudian dilarutkan dalam n-heksan sampai 10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi 1 mg/ml dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam n-heksan sampai 10,0 ml.
3.5.6.4 Pembuatan larutan uji sampel ekstrak n-heksan tinta cumi-cumi
Larutan B diencerkan hingga konsentrasi 100 µg/ml kemudian dibuat seri konsentrasi 10, 18, 32, 58, dan 105 µg/ml. Adapun cara untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak n-heksan yang akan digunakan dalam pengujian dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 51.
Tabel 3.2 Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak n-heksan
Konsentrasi larutan (C1) (µg/ml) Volume larutan stok yang diambil ( V1) (ml)
Volume air laut buatan yang ditambahkan (V2) (ml) Konsentrasi larutan sampel yang diujikan (C2) (µg/ml) 100 0,5 0,9 1,6 5 10 5 18 5 32 1000 0,3 0,5 5 58 5 105
3.5.6.5 Pembuatan larutan A dan B ekstrak etilasetat tinta cumi-cumi
Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml dibuat dengan menimbang 100,0 mg ekstrak etilasetat tinta cumi-cumi kemudian dilarutkan dalam etilasetat sampai 10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi 1 mg/ml dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam etilasetat sampai 10,0 ml.
30
Larutan B, diencerkan hingga konsentrasi 100 µg/ml kemudian dibuat seri konsentrasi ekstrak 2; 2,8 ; 3,9 ; 5,5 ; dan 7,7 µg/ml. Adapun cara untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak etilasetat yang akan digunakan dalam pengujian dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 63.
Tabel 3.3 Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak etilasetat
Konsentrasi larutan Stok
( C1) (µg/ml )
Volume larutan stok yang diambil
( V1) (ml)
Volume air laut buatan yang ditambahkan (V2)
(ml)
Konsentrasi larutan sampel yang diujikan
(C2) (µg/ml) 100 0,1 5 2 0,14 5 2,8 0,19 5 3,95 0,28 5 5,5 0,39 5 7,7
3.5.6.7 Pembuatan larutan A dan B ekstrak etanol tinta cumi-cumi
Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml dibuat dengan menimbang 100,0 mg ekstrak etanol Tinta Cumi-cumi kemudian dilarutkan dalam etanol sampai 10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi 1 mg/ml dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan dalam etanol sampai 10,0 ml.
3.5.6.8 Pembuatan larutan uji sampel ekstrak etanol
Larutan B diencerkan hingga konsentrasi 1 dan 10 µg/ml kemudian dibuat seri konsentrasi 0,1 ; 0,17 ; 0,31 ; 0,55 ; dan 0,98 µg/ml. konsentrasi tersebut diperoleh dengan terlebih dahulu membuat serikonsentrasi 0,1; 1 dan 5 µg/ml kemudian dipilih seri konsentrasi terkecil dan terbesar yang menyebabkan kematian larva. Seri konsentrasi tersebut dihitung dengan faktor pengali sehingga
31
diperoleh seri konsentrasi pengujian terhadap larva. Adapun cara untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak etanol yang akan digunakan dalam pengujian dapat dilihat pada Lampiran 11, halaman 75.
Tabel 3.4 Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak etanol
Konsentrasi larutan Stok ( C1)
(µg/ml )
Volume larutan stok yang diambil (V1)
(ml)
Volume air laut buatan yang ditambahkan (V2) (ml)
Konsentrasi larutan sampel yang diujikan (C2) (µg/ml) 1 0,5 5 0,1 0,88 5 0,17 0.15 5 0,31 10 0,27 5 0,55 0,49 5 0,98 3.5.6.9 Pelaksanaan uji BSLT
Sepuluh ekor larva Artemia salina Leach yang telah berumur 48 jam diambil, dimasukkan dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu yang sebelumnya telah dikeringkan, kemudian ditambahkan air laut buatan sebanyak 3 ml. lalu di tambah 1 tetes suspensi ragi (3 mg ragi dalam 5 ml ALB) sebagai makanan dan air laut buatan sampai 5 ml. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol, yaitu pelarut dengan jumlah yang sama dengan jumlah ekstrak ditambahkan stiap flakon, kemudian setiap konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung untuk mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC50 (Meyer, dkk., 1982).
32
3.5.7 Analisis data
Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis probit untuk menghitung LC50 Persentase kematian
ditentukan dengan rumus Abbot :
% Kematian = x 100%
Perhitungan statistik dilakukan dengan menggunakan program statistik SPSS 17.00. Cara perhitungan statistik dapat dilihat pada Lampiran 7, 10, 13 halaman 58, 71, dan 83.
33