METODE PENELITIAN
3.1. DESAIN PENELITIAN
Penelitian dilakukan secara longitudinal prospektif study
3.2. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara/RSUP H.Adam Malik dan RSU Dr.Pirngadi Medan bekerjasama dengan Departemen Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara/RSUP H.Adam Malik Medan.
Penelitian dimulai pada bulan Desember 2007 sampai Februari 2008 . Penelitian dihentikan bila jumlah sample minimal tercukupi atau bila waktu pengambilan sample telah mencapai 3 bulan.
3.3. POPULASI DAN SUBYEK PENELITIAN
3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi penelitian adalah pasien Demam berdarah Dengue rawat inap yang dinyatakan suspek Demam berdarah Dengue dengan mempergunakan kriteria WHO, oleh dokter Poliklinik dan ruang rawat Ilmu Penyakit Dalam FK USU/RSUP H.Adam Malik/RSU Pirngadi Medan dan
pasien yang dirawat oleh Pembimbing di rumah sakit swasta . Kelompok ini kemudian dilakukan konfirmasi dengan tes antigen Dengue.
3.3.2. Subyek Penelitian
Subyek yang diikutkan dalam penelitian adalah semua pasien DBD dan memenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut :
3.3.3. Kriteria Inklusi
• Bersedia ikut dalam penelitian
• Penderita demam ≤5 hari disertai minimal 2 kriteria di bawah ini : -sakit kepala
- nyeri badan - leher tegang - nyeri orbita
3.3.4. Kriteria Eksklusi
Tidak bersedia ikut dalam penelitian Penderita demam > 5 hari
3.3.5. Kriteria Kontrol
Penderita demam ≤ 5 hari disertai uji NS-1 Ag negatif 3.3.6. Kriteria Drop out
• Penderita tidak bersedia ikut dalam penelitian lagi
3.4. PERKIRAAN BESAR SAMPEL
Sampel dipilih secara random sampling dengan perkiraan besar sampel minimum dari subyek yang diteliti dipakai rumus uji hipotesis rerata dua kelompok independent : 2 n1 = n2 = 2 [z(0,5- /2) + z (0,5 - ) Sd ] ( 1 – 2) 2 = 2 (1,96 + 1,282).0,525 0,5 = 23,17 ≈ 23
n1 = jumlah pasien sampel n2 = jumlah pasien kontrol
Z (0,5- /2) = nilai baku normal dari tabel z yang besarnya tergantung pada nilai yang ditentukan
Untuk = 0,05 z (0,5- /2) = 1,96
Z(0,5- ) = nilai baku normal dari tabel z yang besarnya tergantung pada nilai yang ditentukan
Untuk = 0,01 z(0,5 - ) = 1,282
Setiap pasien baik yang positif (+) atau negatif (-) dengan tes Antigen Dengue dilakukan pemeriksaan Tromboelastograf setiap hari sampai dengan hari ke tiga perawatan. Dari kedua kompok tersebut lalu dilakukan perbandingan antara grup (+) antigen Dengue dengan grup (-) antigen Dengue.
3.5. ANALISA DATA
Pengolahan data dan perhitungan statistik digunakan perangkat software SPSS for Windows versi 14.01 dan Microsoft Excel. Dikatakan signifikan bila nilai p < 0,05.
• Untuk melihat perbedaan proporsi data kategorikal digunakan uji chi square
• Untuk melihat perbedaan rata-rata data metrik berdasarkan 2 kelompok pengamatan digunakan uji t-independent
• Untuk melihat perbedaan rata-rata data metrik berdasarkan >2 kelompok pengamatan digunakan uji Anova.
3.6. BAHAN DAN CARA KERJA 3.6.1. Pengambilan Sampel
Sampel darah diambil dari vena mediana cubiti. Tempat punksi vena terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan punksi. Pengambilan darah dilakukan dengan menggunakan spuit disposibel sebanyak 6cc, lalu darah dibagi atas 3 bagian yaitu :
- 1 cc dengan antikoagulan 1.8mg Ethylen Diamine Tetra Acetat (EDTA) untuk pemeriksaan darah lengkap
- 1.8 cc dengan antikoagulan Natrium citrat 3,8% untuk pemeriksaan dengan thrombelastograf
3.6.2. Pengolahan Sampel
• Darah dengan antikoagulan EDTA dilakukan pemeriksaan darah lengkap
• Darah tanpa antikoagulan (3 cc) dibiarkan dalam suhu ruangan selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 g selama 15 menit, serum dipisahkan secara hati-hati ke dalam tabung plastik tertutup dan segera disimpan ke dalam freezer pada suhu -37 °C sampai dilakukan pemeriksaan Antigen DHF secara serentak setiap bulan
• Darah dengan antikoagulan Natrium citrat 3,8% dilakukan pemeriksaan hemorhagik dengan menggunakan trombelastograf.
Teknik Pemeriksaan Tromboelastografi :
- 1.8 ml darah yang diperoleh dengan vena punksi dimasukkan ke dalam tabung yang berisi Natrium sitrat 0,109 M. Tutup tabung dan campur darah dengan sitrat dengan cara membolak-balik tabung .
- Darah disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan platelet rich plasma (PRP) .
- Masukkan reagen aPTT sebanyak 100uL ke dalam mangkuknya - Masukkan 240uL PRP ke dalam mangkuknya.
-Tambahkan 100uL 0,645%CaCl2 ke dalam mangkuk tersebut.
-Turunkan jarum menuju darah dengan cara menekan knop saluran berlawanan arah jarum jam.
-Tekan marker untuk menentukan starting time.
- Dengan perlahan-lahan teteskan minyak parafin pada permukaan darah. Hindari menyentuh jarum dengan syringe
-Turunkan tutup plexiglass untuk mempertahankan suhu ruang.Biarkan instrumen bekerja paling sedikit selama 1 jam
Hasil akan dicetak pada kertas hasil
Cara Pemeriksaan Antigen Dengue
Pemeriksaan dilakukan serentak sebulan sekali setelah terkumpul sejumlah sampel dengan alat Micro-ELISA reader 250.
• Biarkan semua reagen pada temperatur ruangan (18-30°C). Setiap kali pemeriksaan digunakan 1 kontrol negatif, cut-off duplo dan 1 kontrol positif
• Keluarkan baki carier dan lepaskan plastik proteksinya.
• Secara berurutan teteskan diluent pada sumur : 50uL diluent R7, 50uL sampel (kontrol atau pasien) dan 100uL conjugat (R6+R7).
• Tutup microplate reaksi dengan pembungkus adhesive,tekan sampai seluruhnya tersegel dengan ketat. Inkubasi microplate pada inkubator selama 90 ± 5menit pada 37 ±1°C.
• Persiapakan pengenceran R2. Pada saat akhir periode inkubasi, lepaskan segel. Aspirasi isi seluruh sumur ke dalam tempat
pembuangan. Cuci microplate 6x dengan reagen pencuci (R2). Balikkan microplate dan secara perlahan serap sisa cairan dengan kertas penyerap.
• Siapkan larutan R8+R9 dan secara cepat distribusikan ke dalam tiap sumur sebanyak 160uL. Biarkan bereaksi dalam kamar gelap selama 30±5 menit pada suhu ruangan.
• Tambahkan 100uL R10 (stopping solution) pada tiap sumur. Perlahan-lahan lap dasar plate, kemudian baca densitas optic pada 450nm dengan menggunakan plate reader dalam waktu 30 menit setelah reaksi berhenti.
Pemeriksaan Darah Lengkap
Pemeriksaan darah lengkap dilakukan dengan menggunakan alat Cell Dyne 3700 untuk :
• Pemeriksaan Hb, jumlah lekosit, jumlah trombosit dan hematokrit
• Pemeriksaan hitung jenis lekosit, morfologi darah tepi dilakukan dari sediaan apus darah dengan pewarnaan Giemsa
Pemantapan Kualitas
Oleh karena pemeriksaan dengan Tromboelastografi adalah pemeriksaan fungsi dari trombosit, di mana trombosit merupakan satu-satunya sel darah yang memiliki actin dan myosin yang dapat menyebabkan trombosit dapat berkontraksi dan memiliki elastisitas, maka setiap kali pemeriksaan harus menggunakan plasma segar dan tidak bisa di’pool’, oleh karena plasma yang
di’pool’kan akan menyebabkan kerusakan pada trombosit tersebut sehingga fungsinya akan berkurang. Oleh karena itu setiap kali pemeriksaan digunakan plasma normal segar sebagai kontrol dengan koefisien variasi 5% dari normal maka alat sudah dapat digunakan.
Tabel 1. Nilai normal parameter tromboelastografi
Parameter Mean Standar
Deviasi R-time
K-time
Maximum Amplitude (MA) Angle 4 cm 5 cm 62.2 mm 155 ° 1.33 0.00 9.91 83.98
3.7. KERANGKAKERJA Populasi: Penderita Demam Berdarah Dengue Antigen Dengue Tromboelastografi Inklusi:
Bersedia ikut dalam penelitian Penderita Demam ≤5 hari disertai minimal 2 dari gejala di bawah ini : nyeri kepala, nyeri leher, nyeri badan, nyeri orbita
Eksklusi :
Tidak bersedia ikut dalam penelitian Demam >5 hari
Drop out :
Tidak bersedia lagi ikut penelitian Meninggal
