DAFTAR GAMBAR
2. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 7 bulan, yaitu dari bulan Mei hingga bulan November 2015. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB) Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Kawasan Puspitek Serpong.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah; glassware, rat sonde peroral, kandang dan kelengkapan hewan coba, Microplate 24 & 96 wells (Costar), Mikropipet, Mikroskop, Hemasitometer (Neubauer), Sentrifus (Hettich Micro 22R), Sonikator (Powersonic 410), Inkubator (Memmert), ELISA Microplate Reader ELX 800.
Bahan yang digunakan adalah; Etanol 96% (food grade), EDTA, CMC-Na (Natrium Karboksil Metil Selulosa), aqua bidestilata, Meniran (Phyllanthus niruri L.) Komersial, 7.12-dimetilbenz[α]antrasena (DMBA) (Sigma), minyak jagung, PBS, RPMI 1640 (Gibco), K2HPO4, KH2HPO4, reagen Griess, PBS, FBS (Foetal Bovine Serum), LPS (Lipopolisaccharides), Rat TNF-α ELISA Kit (Thermo SCIENTIFIC), Rat IFN-γ ELISA Kit (Thermo SCIENTIFIC).
Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih galur wistar dari Biofarma, Bandung. Ethical Clearance diperoleh dari Komite Etik FKUI-RSCM Salemba. Sedangkan ekstrak yang digunakan adalah ekstrak etanol tanaman temu ireng dari koleksi kebun Jamu Martha Tilaar.
Rancangan Penelitian
Penelitian merupakan eksperimen hewan coba menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan satuan percobaan homogen. Tikus dibagi ke dalam enam kelompok perlakuan dengan jumlah pengulangan berdasarkan rumus Federer. Tahapan penelitian yang dilakukan terdiri atas persiapan ekstrak temu ireng, adaptasi, induksi preventif ekstrak perlakuan, induksi DMBA, pengambilan plasma darah dan isolasi makrofag peritoneal. Analasisi NO dilakukan pada 2 waktu sedangkan analisis IFN- dan TNF-α dilakukan pada 4 waktu berbeda.
Penyiapan Hewan Coba
Penelitian ini merupakan kajian percobaan pada hewan coba tikus betina galur Wistar berumur 1,5 bulan dengan bobot ± 60 gram dan sehat secara fisik yang ditandai bulu tidak berdiri, warna putih bersih, mata jernih, tinja tidak lembek, tingkah laku normal dan aktif. Tikus diaklimatisasi selama tujuh hari di Laboratorium Farmakologi LAPTIAB sebelum diberi perlakuan. Hal tersebut bertujuan untuk mengadaptasi hewan coba dengan lingkungan baru dan memperkecil pengaruh stres terhadap metabolisme yang dapat mengganggu hasil pengamatan. Hewan coba di tempatkan pada kandang yang diisi 5 ekor dengan suhu ruangan 20–26 oC (Air Conditioner), kelembaban udara (Rh) 60-70%, perlakuan 12 jam gelap dan terang.
Perlakuan Hewan Coba
Sebanyak 60 ekor tikus dibagi kedalam 6 kelompok yaitu: kelompok kontrol Normal, yaitu kelompok yang tidak diberikan perlakuan. Kelompok kontrol (+) Meniran adalah kelompok pembanding positif, tikus diberikan ektrak meniran (Phyllanthus niruri L.) 40mg/200g BB dan 4mg/200g BB DMBA. Kelompok ketiga (DMBA) adalah kelompok pembanding negatif, tikus hanya diberika n 20mg/KgBB DMBA. Kelompok keempat (PTI-1) yaitu tikus yang diberikan ekstrak TI dosis 40mg/200gBB dan 24mg/200g BB DMBA. Kelompok kelima (PTI-2) yaitu tikus yang diberikan ekstrak TI dosis 80mg/200gBB dan 20mg/KgBB DMBA. Kelompok keenam (PTI-3) yaitu tikus yang diberikan ektrak TI dosis 160mg/200gBB dan 20mg/KgBB DMBA.
Alur penelitian dimulai dengan mengadaptasikan tikus selama satu minggu dengan lingkungan baru. Kemudian selama satu minggu tikus diberikan perlakuan Meniran dan TI berdasarkan dosis yang d isebutkan diatas, sedangkan kelompok 1 dan Kelompok 3 hanya diberikan induksi CMC-Na 0.5%. Dua minggu selanjutnya tikus diinduksi dengan DMBA sebanyak 5 kali dengan interval 3 hari, pada minggu ini perlakuan Meniran dan TI tetap diberikan. Pada minggu kelima hingga minggu kedua puluh tikus diberikan perlakuan berdasarkan kelompoknya.
Penyiapan Ekstrak Temu ireng
Pembuatan ekstrak dimulai dengan rimpang temu ireng dicuci bersih dan dirajang halus dan dikeringkan dalam oven 40 oC, simplisia tersebut dihaluskan hingga berukuran serbuk. 5 Kg simplisia dimasukkan kedalam maserator dan ditambahkan 6 L etanol food grade hingga seluruh serbuk terendam, diaduk selama 6 jam dan dikeringkan menggunakan kertas saring (triplo). Filtrat dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang diberikan secara oral pada hewan coba dilarukan dalam pelarut CMC-Na 0.5% (500 mg CMC-Na ditakar hingga 1000 ml dengan aquades). Ekstrak temu ireng dibagi kedalam tiga dosis, yaitu PTI-1 dengan dosis 40 mg/200g BB, PTI-2 dengan dosis, 80 mg/200g BB dan PTI-3 dengan dosis 160 mg/200gBB. Ketiga dosis ini diberikan setiap hari secara oral hingga akhir penelitian.
Penyiapan larutan stok DMBA
Larutan stok DMBA dibuat sebanyak 30 mL. Sebanyak 120 mg serbuk DMBA ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung, lalu ditambahkan 10 mL minyak jagung dan dilarutkan menggunakan sonikator. Setelah larut sempurna ditambahkan minyak jagung hingga diperoleh volume 30 mL.
Induksi Karsinogenesis dengan DMBA
Senyawa DMBA dengan konsentrasi 20 mg/kgBB yang dilarutkan dengan minyak jagung sampai homogen diinduksi pada tikus. Induksi karsinogen DMBA dilakukan peroral dengan dosis 20 mg/kgBB 3 hari sekali sebanyak 5 kali
Pengambilan Darah
Darah diambil melalui sinus orbital mata kanan atau kiri sebanyak ± 2 cc, kemudian ditampung dalam tabung yang sudah diberikan EDTA sebagai antikoagulan. Kemudian darah disentrifus pada 10000 rpm selama 10 menit, kemudian plasma dipindahkan ke tabung baru.
Isolasi Makrofag Peritoneal
Tikus dimatikan melalui dislokasi tulang leher, lalu tikus diletakkan dalam posisi terlentang, kemudian kulit bagian perut dibuka dan selubung peritoneum dibersihkan dengan alkohol 70%. Sebanyak 10 ml medium RPMI 1640 diinjeksikan secara intraperitoneal menggunakan spuit. Kemudian dibiarkan selama 3 menit sambil ditekan-tekan perlahan atau digerakkan supaya medium menyebar ke seluruh bagian peritoneal dan sel makrofag disuspensikan. Cairan peritoneum diaspirasi dengan cara menekan organ dalam dengan jari jari kemudian cairan diambil menggunakan jarum spuit secara intraperitoneal pada bagian yang tidak berlemak dan jauh dari usus. Aspirat yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm pada suhu 4 °C selama 10 menit. Endapan disuspensikan dalam medium RPMI 1640-FBS. Sebanyak 10 µL suspensi sel diteteskan ke dalam hemositometer kemudian
dihitung jumlah sel pada 4 bilik dan disuspensikan dengan kerapatan sel 2.5x10 sel/ml. Plate diinkubasi dalam inkubator CO2 5%, suhu 37 oC selama 15 menit. Lalu ditambahkan 1 ml RPMI komplit ke dalam setiap well, plate diinkubasi kembali selama 2 jam, lalu media dibuang dan well dibilas dengan media basal sebanyak 2 kali dan ditambahkan 1 ml RPMI 1640-FBS dan diinkubasi 24 jam dalam inkubator CO2 5%, suhu 37 oC.
Pengukuran Kadar NO (Nitrit Oksida)
Setelah 24 jam, plate dikeluarkan dari inkubator, lalu 100 µL supernatan dimasukkan ke dalam plate 96 well. Sebanyak 100 µL reagen Griess ditambahkan kesetiap well, lalu plate dibungkus dengan aluminium foil atau dibiarkan ditempat gelap selama 10 menit. Terakhir diukur menggunakan ELISA Readerpada =546 nm. Larutan standar NO dibuat dari 5 mg Natrium Nitrit yang dilarutkan dalam 5 ml aqua bidestilata (konsentrasi larutan 1000 ppm). Dilakukan pengenceran hingga diperoleh larutan standar dengan konsentrasi 25 ppm, 12.5 ppm, 6.25 ppm, 3.125 ppm, 0.156 ppm dan 0.75 ppm. Kemudian dibuat kurva standar menggunakan analisis regresi linear sederhana dan digunakan untuk menghitung konenstrasi nitrit dari sampel.
Pengukuran IFN-γ & TNF-α (The rmo SCIEN TIFIC)
Pengujian dilakukan menggunakan Rat IFN-γ & TNF-α ELISA Kit. Wash buffer dibuat dengan pengenceran 24x dari larutan konsentrat. Standar disiapkan dengan memasukkan 150 µL standar ke dalam tabung dan dihomogenkan, lalu dilakukan pengenceran bertingkat dari konsentrasi 500 pg/mL hingga didapat enam konsentrasi.
Microplate di kelompokkan ke dalam standar dan sampel masing- masing 1 strip well, sebanyak 50 µL sampel & 50 µL standar dimasukkan dalam well, kemudian plate diinkubasi pada suhu ruang (20-25 oC) selama 1 jam. Kemudian plate dicuci dengan wash buffer (3X) dan ditambahkan 100 µL reagent biotinylat antibodi kesemua well dan diinkubasi pada suhu ruang (20-25 oC) selama 30 menit. Plate dicuci dengan wash buffer (3X) dan ditambahkan 100µL solusi streptavidin- HRP, lalu diinkubasi kembali pada suhu ruang (20-25 oC) selama 30 menit. Plate dicuci dengan wash buffer (3X) dan ditambahkan 100 µL substrat TMB kesetiap well. Plate di tutup dengan strip penutup dan diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit. Setelah 30 menit ditambahkan 100 µL stop solution kesetiap well dan diukur pada kur absorbansi pada 450 nm
Analisis Data
Data penelitian berupa kadar NO dianalisis secara statistika dengan uji analysis of variant (ANOVA). Apabila terdapat perbedaan nyata dilakukan uji lanjut menggunakan uji Tukey dengan taraf kepercayaan sebesar 95% (α=0,05). Sedangkan IFN- dan TNF-α dilakukan analisis dua arah, yaitu terhadap perlakuan dan waktu. Apabila tidak ditemukan perbedaan yang bermakna, maka dilanjutkan dengan analisis deskriptif.
3. HASIL
Insidensi Tumor
Insidensi adalah perbandingan antara jumlah hewan coba yang terkena tumor dengan total hewan coba dalam 1 kelompok perlakuan dikali 100%. Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa, angka insidensi tertinggi ditunjukkan oleh kelompok kontrol negatif DMBA sebesar 100%, artinya semua tikus pada kelompok tersebut terkena tumor. Kemudian diikuti oleh kelompok PTI-1 dan PTI-3 sebesar 62.5%. Sedangkan insidensi pada kelompok PTI-2 masing sebesar 50%. Dari data tersebut dapat dilihat bahwa kelompok dengan dosis paling efisien dalam mengurangi angka insidensi adalah PTI-2. Berdasarkan angka insidensi pada kelompok DMBA, maka model kanker pada penelitian ini dapat diterima.
Tabel 1 Angka insidensi pada berbagai kelompok perlakuan (BPPT 2015, Data tidak dipublikasi)
Kel ompok Normal Meniran DMBA PTI-1 PTI-2 PTI-3
Insidensi (% ) 0 75 100 62.5 50 62.5
Hasil Analisis Sekresi NO (Nitric Oxide)
Analisis sekresi NO makrofag peritoneum tikus dilakukan 2 kali, uji sekresi NO pertama dilakukan pada minggu ke-5 (T2) atau seminggu setelah induksi DMBA terakhir. Dosis DMBA yang diberikan adalah 4 mg/200g BB selama 5 kali dengan selang 3 hari sekali, DMBA diberikan selama 2 minggu. Pada mingu ini hewan coba tetap mendapatkan perlakuan berdasarkan kelompoknya (PTI & Meniran), sedangkan kelompok Normal dan DMBA diberikan CMC-Na 0.5% sebagai pengganti perlakuan untuk menyamakan tingkat stres. Jumlah sekresi NO makrofag peritoneum tikus pada minggu ke-5 (T2) disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan Tabel 2 dapat dilihat bahwa, kadar NO makrofag kelompok PTI-2 dan PTI-3 (P<0.05) signifikan lebih tinggi dibandingkan kontrol Normal. Sedangkan PTI-1 signifikan lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol. Berdasarkan uji lanjut antar kelompok menunjukkan bahwa PTI-2 signifikan lebih tinggi dari PTI-1 dan PTI-3, PTI-3 signifikan lebih tinggi dari PTI-1. Namun, berdasarkan kadar NO PTI-1 dan PTI-3, kelompok ini belum mengalami inflamasi.
Tabel 2 Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T2
Kelompok Konsentrasi NO (ppm)
Kontrol Normal (CMC-Na) 0.384±0.04
Kontrol (+) Meniran (40 mg/200g BB) 1.621±0.57 Kontrol (-) DMBA (20 mg/kgBB) 1.379±0.36 PTI-1 (dosis 40 mg/200g BB) 0.31±0.006 PTI-2 (dosis 80 mg/200g BB) 2.867±0.51 * PTI-3 (dosis 160 mg/200g BB) 0.642±0.08 # Keterangan : (*) signifikan lebih tinggi dari Kontrol, (#) signifikan lebih tinggi dari Kontrol Normal
Analisis sekresi NO makrofag peritoneum tikus selanjutnya dilakukan pada (T3). Data jumlah sekresi NO makrofag peritonesum tikus minggu ke-20 disajikan pada Tabel 3. Analisis statistik dengan ANOVA terhadap sekresi NO makrofag pada T3 menunjukkan paling tidak ada dua kelompok perlakuan yang berbeda signifikan (Fhit (4.135) > Ftabel (2.51)). Berdasarkan uji lanjut pada T3 diperoleh hasil sebagai berikut; PTI-1 dan PTI-3 signifikan lebih tinggi dari Kontrol Normal. Sedangkan rata-rata NO tertinggi ditunjukkan oleh PTI-3, lalu diikuti oleh PTI-1 dan PTI-2. Dan rerata kadar NO semua kelompok perlakuan lebih tinggi dibandingkan Kontrol Normal pada T3. Hanya kelompok PTI-2 mengalami penurunan kadar NO pada T3. Tabel 3 Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T3
Kelompok Konsentrasi NO (ppm)
Kontrol Normal (CMC-Na) 0.536 ± 0.258 Kontrol (+) Meniran (40 mg/200g BB) 0.688 ± 0.205 Kontrol (-) DMBA (20 mg/kgBB) 1.624 ± 0.706 PTI-1 (dosis 40 mg/200g BB) 1.873 ± 1.018 # PTI-2 (dosis 80 mg/200g BB) 1.218 ± 0.441 PTI-3 (dosis 160 mg/200g BB) 2.744 ± 0.953 # Keterangan : (#) signifikan lebih tinggi dari Kontrol Normal
Analisis selanjutnya dilakukan terhadap pengaruh waktu pada T2 terhadap T3. Perbandingan sekresi NO makrofag pada berbagai perlakuan terhadap waktu dapat dilihat pada Gambar 1. Pada gambar tersebut dapat dilihat bahwa kelompok PTI-2 menunjukkan bahwa, level NO pada T2 signifikan lebih tinggi terhadap T3. Sedangkan PTI-1 dan PTI-3, level NO pada T3 signifikan lebih tinggi terhadap T2.
Gambar 1 Perbandingan sekresi NO makrofag terhadap waktu. (*) signifikan tinggi terhadap waktu T2/T3 Keterangan: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Norma l Menira n DMBA PTI-1 PTI-2 PTI-3
Hasil Analisis Kadar IFN-γ
Analisis kadar IFN- dilakukan terhadap plasma darah yang diambil dari tikus pada empat waktu berbeda. Berdasarkan Tabel 4 dapat dilihat bahwa bahwa pengaruh perlakuan terhadap level IFN- pada T0 menunjukkan perbedaan signifikan pada PTI-1 dan PTI-2 terhadap Normal. Pada T1 signifikansi ditunjukkan oleh semua PTI terhadap Normal dan DMBA. Pada T2 kelompok PTI-1 dan PTI-2 signifikan lebih tinggi terhadap kelompok kontrol. Dan pada T3 kelompok PTI-2 dan PTI-3 signifikan lebih tinggi terhadap PTI-1 dan kontrol. Tetapi kelompok PTI-1 lebih rendah dari DMBA.
Tabel 4 Level IFN- (pg/mL) pada berbagai perlakuan berdasarkan waktu.
T Normal Meniran DMBA PTI-1 PTI-2 PTI-3 T0 45.17±0.14c 48.17±10.48bc 42±4.63tn 47.5±0.95b 62.83±12.38a 47±4.89tn T1 43.16±0.13c 58.67±16.33tn 49.33±8.16c 75.93±8.31b 85.39±3.04a 62.67±15.3b T2 41.34±0.27c 45.17±0.95b 46.28±3.89b 57.89±5.76a 60.06±8.03a 49.78±10.91tn T3 42.33±0.27c 42.5±1.49c 50±0.82b 41.17±2.04c 55.17±3.4a 55.83±1.49a Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata, (tn) tidak berbeda nyata (Uji Tukey’s P<0.05)
Data dari Tabel 4 disajikan kembali dalam bentuk grafik untuk melihat pola dari level IFN- . Gambar β menunjukkan bahwa tidak ditemukan pola yang bermakna pada kelompok perlakuan pada setiap waktu. Namun, secara rata-rata terdapat peningkatan kadar IFN- pada T1 dibandingkan waktu yang lain. Dan kadar IFN- menurun pada Tβ dan Tγ
Gambar 2 Pengaruh antar perlakuan terhadap IFN- pada berbagai waktu. Tanda (*) signifikan terhadap kontrol Normal (P<0.05)
Keterangan: 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 T0 T1 T2 T3
*
*
*
*
* *
*
Pengaruh perlakuan terhadap level IFN- pada berbagai waktu ditunjukkan oleh Gambar 3. Pada kelompok PTI-1 terdapat perbedaan yang signifikan pada; T0 lebih kecil pada T1 dan T2, T1 lebih tinggi dari semua T, T2 lebih tinggi T0 dan T3. Kelompok PTI-2, signifikansi ditunjukkah oleh T1 lebih tinggi dari semua T. Sedangkan pada kelompok PTI-3, T3 signifikan lebih tinggi dari T0.
Gambar 3 Pengaruh waktu terhadap level IFN- pada setiap kelompok perlakuan. Keterangan: (*) signifikan terhadap semua T, (a) signifikan terhadap T0, (c) signifikan terhadap T2, (d) signifikan terhadap T3.
Keterangan:
Hasil Analisis Kadar TNF-α
Hasil analisis menunjukkan terdapat perbedaan signifkan antara pengaruh perlakuan terhadap kadar TNF-α ditunjukkan oleh Tabel 5. Pada T0, kelompok PTI-2 signifikan lebih tinggi dari PTI-1, Meniran dan DMBA. Pada T1, kelompok PTI-3 lebih tinggi dari PTI-2 dan Meniran, tetapi PTI-2 lebih tinggi dari Normal. Pada T2, Kelompok PTI-2 signifikan lebih tinggi dari kelompok lainnya. Kelompok PTI-3 lebih tinggi dari PTI-1, Normal dan DMBA. Kelompok PTI-1 lebih tinggi dari Normal. Pada T3, Kelompok PTI-1 lebih rendah dari kelompok perlakuan lain, sedangkan PTI-2 dan PTI-3 lebih tinggi dari DMBA.
Tabel 5 Level TNF-α (pg/mL) pada berbagai perlakuan terhadap waktu
T Normal Meniran DMBA PTI-1 PTI-2 PTI-3
T0 44.5±4.08ac 23.75±13.27b 35.5±10.61c 34±10.61c 51.75±3.06a 45.5±11.02tn
T1 48.75±1.42c 49.5±10.21b 54.25±12.04tn 61.33±6.81ab 55.33±2.74b 63.17±0.88a
T2 48.75±4.28d 86.75±42.25bcd 73.25±34.91cd 96.17±2.17c 136±1.61a 114.33±2.03b
T3 34.5±17.15bc 45.75±4.69c 18.75±2.65b 10±3.67a 56.75±19.8c 45±1.22c Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata, (tn) tidak berbeda nyata (Uji Tukey’s P<0.05)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Norma l Menira n DMBA PTI-1 PTI-2 PTI-3
*
*
a c d aPengaruh perlakuan terhadap kadar TNF-α pada berbagai waktu perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4. Secara umum terjadi peningkatan kadar TNF-α pada T1 atau seminggu setelah perlakuan. Pada T2, terjadi peningkatan yang signifikan pada semua kelompok perlakuan (PTI) terhadap kontrol Normal. Pada T3, kadar TNF-α turun cukup signifikan pada semua kelompok perlakuan dibandingkan T2.
Gambar 4 Pengaruh antar perlakuan terhadap TNF-α pada berbagai waktu. Tanda (*) menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap Normal (P<0.05)
Keterangan:
Gambar 5 Pengaruh waktu terhadap level TNF-α. (*) signifikan terhadap semua T, (a) signifikan terhadap T0, (b) signifikan terhadap T3.
Keterangan: 0 20 40 60 80 100 120 140 160 T0 T1 T2 T3 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Norma l Menira n DMBA PTI-1 PTI-2 PTI-3
*
*
*
*
*
*
*
*
a b a b b*
*
Pengaruh perlakuan terhadap waktu dapat dilihat pada Gambar 5. Secara keseluruhan, level TNF-α tidak naik dari T0 ke T1. Sedangkan peningkatan secara signifikan terjadi waktu T2 pada semua kelompok perlakuan PTI terhadap waktu (T). Kemudian dari T2 ke T3 mengalami penurunan pada semua perlakuan dan yang signifikan lebih rendah ditunjukkan oleh kelompok PTI-1, PTI-2, PTI-3 dan DMBA terhadap waktu T2 (P<0.05).
4. PEMBAHASAN
Insidensi Tumor
Hasil penelitian terhadap aktivitas kemopreventif ekstrak etanol temu ireng pada tikus galur wistar menunjukkan angka insidensi yang rendah pada PTI-2, yaitu sebesar 50%. Berdasarkan angka insidensi pada Gambar 1, dapat dikatakan bahwa angka insidensi tumor tidak dipengaruhi oleh dosis yang diberikan. Dosis PTI-3 merupakan dosis tertinggi, tetapi dosis tersebut belum mampu menekan angka insidensi yang mencapai 62.5%. Hal yang sama juga terjadi pada dosis PTI-1 yang memiliki angka insidensi 62.5%. Sedangkan pada kelompok kontrol (-) DMBA, angka insidensi mencapai 100% dan kontrol (+) Meniran sebesar 75%. Berdasarkan angka tersebut, dapat dikatakan bahwa model penelitian kanker ini dapat diterima berdasarkan kontrol negatif (DMBA). Angka insidensi tumor pada tikus dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal, faktor internal adalah pengaruh induksi DMBA dan aktivitas imunostimulator ekstrak temu ireng. Sedangkan faktor eksternal berupa pengaruh lingkungan dan musim. Angka insidensi pada tikus dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal (lingkungan dan musim) (Kubatka et al. 2002)
Nitrit Oksida (N O)
Nitrit oxide (NO) adalah radikal bebas yang disintesis oleh enzim Nitric Oxide Synthase (NOS) melalui reaksi yang kompleks. NO disintesa di dalam sel selama proses oksidasi L-arginine yang dikatalis oleh enzim Nitric Oxide Synthase (NOS). Proses tersebut membutuhkan Flavin Adenin Dinucleotidase (FAD), Flavin Mononucleotidase (FMN), NADP yang tereduksi (NADPH), dan bentuk tereduksi dari biopterin (BH4) sebagai kofaktor (Aktan 2004; Lechner et al. 2005). Aktivitas NOS terdeteksi pada berbagai jenis sel kanker, serta dihubungkan dengan stadium kanker, tingkat proliferasi sel, dan ekspresi komponen yang terlibat terhadap kanker seperti oestrogen reseptor (Xu et al. 2005; Mustarichiei et al. 2014).
Temu ireng diketahui memiliki aktivitas sebagai pro- dan antiinflmasi. Saat dilakukan pemberian DMBA maka proses inflamasi harus teraktivasi, sehingga senyawa-senyawa aktif yang memiliki aktivitas anti inflamasi harus dihilangkan seperti zedoarondiol, 1,8-cineol dan curzerenone (Raenmongkol et al. 2006; Cho et al. 2009; Afzal et al. 2013). Sebaliknya, ketika proses inflamasi menjadi kronis, maka senyawa aktif yang bersifat pro inflamasi dibutuhkan seperti germakron, isokurkumol dan kurkumenol (Sun et al. 2010; Laskmi et al. 2011; Liu et al. 2013). Pada mekanisme produksi NO, senyawa aktif temu ireng bekerja pada jalur NF-kB dan IRF-1 serta melalui peningkatan produksi sitokin inflamasi pada sel monosit.
Uji sekresi NO makrofag peritoneum pertama dilakukan satu minggu setelah induksi DMBA terakhir atau pada minggu kelima (T2). Jumlah NO peritoneum tikus minggu kelima (T2) dapat dilihat pada Tabel 1. PTI-2 merupakan kelompok dengan dosis yang paling efektif dalam meningkatkan jumlah sekresi NO pada tikus yang diinduksi DMBA. Berdasarkan kejadian ini dapat dikatakan sistem imun aktif bekerja setelah pemberian DMBA. Selain itu, temu ireng diketahui mampu bertindak sebagai imunostimulan dengan meningkatkan aktivitas makrofag melalui sekresi NO (Handayani 2015). Jumlah sekresi NO paling rendah ditunjukkan oleh perlakuan PTI-1 dan PTI-3, walaupun temu ireng diketahui memiliki aktivitas imunostimulan, namun belum mampu meningkatkan jumlah NO pada kelompok tersebut. Hal ini disebabkan kemampuan imunosupresif DMBA lebih kuat dibandingkan kemampuan ekstrak temu ireng dalam meningkatkan aktivitas imun. Selain itu, senyawa aktif yang memiliki aktivitas antiinflamasi juga berperan penting dalam produksi NO pada sel. Senyawa antiinflamasi akan menghambat enzim iNOS dalam meproduksi NO . Sedangkan kelompok DMBA mampu mensekresikan NO melalui proses inflamasi yang diaktivasi oleh berbagai sitokin (IL-1α/IL-1 , PPARs, IFN- , TNF-α) dan produksi protein STING (Stimulator of Interferon Genes), sehingga akan memacu makrofag untuk memproduksi NO (Hedl & Abraham 2003; Gordon et al. 2005; Van Ginderachter et al. 2008; Rongvaux et al. 2014; White et al. 2014; Barber 2015).
Uji sekresi NO selanjutnya dilakukan pada minggu ke-20 (T3). Perbandingan kadar NO makrofag peritoneum tikus minggu ke-20 dapat dilihat pada Tabel 2. Kadar NO peritoneum kelompok kontrol negatif DMBA mengalami kenaikan dibandingkan waktu T2. Metabolit aktif DMBA mampu menyebabkan proses inflamasi terhadap organ sekitar mammae, sehingga memacu produksi sitokin IL-1 , IFN- dan TNF-α melalui jalur STING (Devine et al. 2012; Barber 2015). Sitokin IL-1α yang telah aktif, akan dipindahkan ke wilayah ekstraseluler dan mengaktivasi respon imun lainnya dalam mempromosikan reaksi inflamasi (Rider et al. 2011). Sitokin IL-1 dapat memicu aktivasi sel T untuk menghasilkan IFN- yang dapat meningkatkan ekspresi iNOS dan COX-2 sehingga menimbulkan reaksi inflamasi. Sitokin IL-1α berperan dalam aktivasi sel T untuk meningkatkan ekspresi reseptor terhadap Interleukin 2 (IL-2). Selain itu IL-1α dapat meningkatkan jumlah IFN- dan mengaktivasi makrofag untuk menghasilkan TNF-α (Germano et al. 2008). Ekspresi iNOS akan meningkat dengan adanya IL-1 , IFN- , TNF-α, LPS dan stres oksidatif sehingga memacu sekresi NO (Aktan 2004; Lechner et al. 2005; Vannini et al. 2015). Pengaruh waktu terhadap kadar NO antara T2 dan T3 dapat dilihat pada Gambar 1. Dari gambar tersebut dapat dilihat bahwa, level NO PTI-2 pada T2 signifikan lebih tinggi terhadap T3. Sedangkan level NO PTI-1 dan PTI-3 signifikan lebih tinggi pada T3 dibandingkan T2. Jumlah NO yang tinggi pada T2 menandakan sistem imunitas bekerja dengan baik dan terjadi respon inflamasi terhadap bahan karsinogen DMBA. NO yang tinggi akan menghambat proses metabolisme DMBA menjadi DMBA-diol epoxide (DMBA-DE) dan melindungi sel dari malignan. Pada T3, jumlah NO kelompok PTI-1 dan PTI-3 signifikan lebih tinggi dibandingkan T2. Namun kondisi ini berbanding lurus dengan angka insidensi tumor pada kelompok tersebut. Kejadian ini sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa, sistem imun non-spesifik tidak bekerja efektif pada T3 atau saat tumor sudah mencapai fase
metastasis dan invasif (Di Piro et al. 2005; Vannini et al. 2015). Sebagai bagian dari sistem imun, jumlah NO yang tinggi pada T3 merupakan bentuk pertahanan dan respon inflamasi terhadap bahan berbahaya. Sedangkan jumlah NO yang rendah adalah kegagalan dari sistem imun sehingga akan membuat proses inflamasi menjadi kronis (Kemp 2005).
Nitrit Oksida (N O) dan Tumor
Ekspresi iNOS yang tinggi akan menghasilkan kemampuan sitostatik dan sitotoksik terhadap sel tumor, sedangkan ekspresi iNOS yang rendah akan memberikan efek sebaliknya dan mempromosi pertumbuhan tumor (Xu et al. 2002; Lechner et al. 2005; Vannini et al. 2015). Hubungan tersebut dapat diamati dengan membandingkan kadar NO dan angka insidensi pada kelompok PTI. Kadar NO yang tinggi setelah induksi DMBA (T2) adalah respon imun dalam mempromosikan proses inflamasi dan pertahanan tubuh terhadap bahan karsinogen. Sedangkan jumlah NO yang tinggi pada T3 berkorelasi dengan sistem pertahanan, perbaikan jaringan dan homeostasis. Kejadian ini ditemukan pada kelompok PTI-2, dimana kelompok ini memiliki NO yang tinggi dibandingkan Normal pada T2 dan T3 serta angka insidensi 50%. Kejadian sebaliknya ditemukan pada kelompok PTI-1 dan PTI-3 dengan kadar NO yang rendah pada T2. Jumlah NO yang rendah merupakan kegagalan sistem imunitas sehingga akan menyebabkan inflamasi menjadi kronis dan produksi NO menjadi tidak terkontrol. Jumlah NO yang tinggi pada T3 kelompok PTI-1 dan PTI-3