BAB III METODE PENELITIAN
3.4 Metode Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel saus cabai dilakukan secara purposif yaitu didasarkan pada produk yang beredar dipasaran baik yang bermerek dan yang tidak
bermerek. Pengambilan sampel didasarkan atas pertimbangan bahwa sampel yang diambil dapat mewakili seluruh populasi sampel yang beredar di kota Medan dan sampel yang dianalisis dianggap sebagai sampel yang representatif (Sudjana, 2002).
Lokasi pengambilan sampel yang bermerek dilakukan di Swalayan Carrefour di Jalan Jamin Ginting, dan untuk sampel yang tidak bermerek dilakukan di beberapa kantin di Universitas Sumatera Utara, dan di beberapa tempat penjual makanan jajanan yang ada di Jalan Jamin Ginting, Jalan dr. Mansur, dan Jalan Setia Budi di Kota Medan.
3.5 Prosedur Kerja
3.5.1 Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B 3.5.1.1 Metode Kromatografi Lapis Tipis
Bulu domba direndam selama 24 jam dengan sabun, dicuci hingga bersih dengan air, dikeringkan. Bulu domba kering direndam dengan n-heksan, dikeringkan (Ditjen POM, 2000).
Larutan A dibuat dengan cara menimbang 30 g sampel, dilarutkan dalam 50 ml aquades, ditambahkan 2 ml asam asetat 6%, dimasukkan 50 mg bulu domba, dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk sampai warna terserap. Bulu domba berwarna dicuci berulang-ulang dengan 100 ml aquades hingga bersih. Bulu domba bersih dimasukkan ke cawan penguap, ditambahkan 10 ml NH4OH 10%, dipanaskan di atas penangas air hingga warna bulu domba luntur. Larutan dikumpulkan dalam cawan penguap, diuapkan di atas penangas air hingga kering lalu dilarutkan dalam 2 ml aquades (Ditjen POM, 2000).
Larutan B dibuat dengan cara menimbang 30 g sampel, dilarutkan dengan 50 ml aquades. Ditimbang 50 mg rhodamin B, dimasukkan ke setiap larutan sampel, dicampur homogen, tambahkan asam asetat 6%, kemudian dibuat perlakuan yang sama seperti pembuatan larutan A (Ditjen POM, 2000). Larutan C dibuat dengan cara menimbang 50 mg rhodamin B, dilarutkan dalam 100 ml aquades (Ditjen POM, 2000).
Plat kromatografi lapis tipis (KLT) diaktifkan dengan cara dipanaskan di dalam oven pada suhu 100°C selama 30 menit. Larutan A, B, C, masing-masing ditotolkan pada plat menggunakan pipa kapiler pada jarak 2 cm dari bagian bawah plat dan jarak antar noda adalah 1 cm, dibiarkan beberapa saat hingga mengering. Plat KLT yang mengandung cuplikan dimasukkan ke chamber yang terlebih dahulu telah dijenuhkan dengan 60 ml eluen berupa n-butanol, asam asetat glasial dan aquades (40 : 10 : 24), chamber ditutup dan dibiarkan eluen naik sampai batas atas plat. Plat diangkat, dibiarkan kering di udara. Bercak diamati, jika dilihat secara visual bercak berwarna merah jambu dan di bawah sinar uv 254 nm berfluoresensi kuning, menunjukkan adanya rhodamin B. Selanjutnya dihitung harga Rf bercak (Ditjen POM, 2000).
Rumus perhitungan harga Rf (Stahl, 1985): Harga Rf = awal titik dari depan garis jarak awal titik dari bercak pusat k jarak titi
3.5.1.2 Metode Spektrofotometri Sinar Tampak
Larutan uji sebanyak 50 ml dibuat dengan cara menimbang 15 g sampel saus cabai yang telah dihomogenkan, dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, ditambah dengan 100 ml larutan amonium hidroksida 2%, didiamkan 24 jam
sehingga semua pewarna larut. Larutan disaring, diuapkan di atas penangas air hingga kering. Sisa penguapan dilarutkan secara kuantitatif dengan 30 ml aquades, dimasukkan ke dalam corong pisah 250 ml, ditambahkan 6 ml natrium hidroksida 10%, diekstraksi dengan 30 ml dietil eter. Ekstrak dietil eter dipisahkan, dicuci dengan 30 ml natrium hidroksida 0,5%. Ekstrak dietil eter diekstraksi tiga kali, tiap kalinya dengan 10 ml asam klorida 0,1 N, lapisan dietil eter dibuang. Ekstrak asam klorida 0,1 N ditampung dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan asam klorida 0,1 N sampai tanda. Ekstrak asam klorida dipipet 5 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan asam klorida 0,1 N sampai tanda lalu larutan diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 450-750 nm (Ditjen POM, 2006).
3.5.2 Penetapan Kadar Rhodamin B
3.5.2.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Rhodamin B 3.5.2.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku I
Rhodamin B ditimbang 50 mg, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan asam klorida 0,1 N. Selanjutnya diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda.
Konsentrasi larutan induk baku I = 50 mg
50 ml x 1000 mcg/ml = 1000 mcg/ml.
3.5.2.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku II
Larutan induk baku I dipipet 2,5 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml. Selanjutnya diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda.
Konsentrasi larutan induk baku II = 2,5 ml
3.5.2.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Rhodamin B
Larutan induk baku II dipipet 3 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda, diukur serapan pada panjang gelombang 450-750 nm. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko.
3.5.2.3 Penentuan Waktu Kerja Rhodamin B
Larutan induk baku II dipipet 3 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda, diukur serapan pada panjang gelombang 557 nm selama 30 menit. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko.
3.5.2.4 Kurva Kalibrasi Larutan Rhodamin B
Larutan induk baku II dipipet sebanyak 2; 2,5; 3; 3,5; 4 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda (konsentrasi larutan 2; 2,5; 3; 3,5; 4 mcg/ml). Serapannya diukur pada panjang gelombang 557 nm. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko.
3.5.2.5 Penetapan Kadar Rhodamin B pada Sampel
Rhodamin B pada sampel saus cabai diisolasi (prosedur kerja 3.5.1.2). Diukur serapannya pada panjang gelombang 557 nm. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko. Kadar rhodamin B dalam sampel dapat dihitung dengan persamaan regresi y = ax + b.
Rumus perhitungan kadar rhodamin B: K = X x V x Fp Berat sampel (g)
Keterangan: K = Kadar rhodamin B dalam sampel (mcg/g) X = Kadar rhodamin B sesudah pengenceran V = Volume sampel (ml)
3.5.3 Pemeriksaan Kualitatif Natrium Benzoat
Larutan uji dibuat dengan cara menimbang 50 g sampel, dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, ditambahkan dengan 10 ml natrium hidroksida 10%, dilarutkan dengan larutan natrium klorida jenuh sampai garis batas, dihomogenkan. Larutan dibiarkan selama 2 jam, dikocok, disaring, filtratnya dimasukkan ke dalam corong pisah sebanyak 50 ml, diasamkan filtratnya dengan asam klorida (1:3) pH 2,5-4, diekstraksi dengan 10-15 ml dietil eter. Lapisan dietil eter dipisahkan ke gelas erlenmeyer, diuapkan di atas penangas air. Sisa penguapan ditambahkan 1 ml larutan amonium hidroksida 2%, diuapkan lalu diuji dengan larutan besi (III) klorida 5%. Endapan kecoklatan yang terbentuk menunjukkan adanya natrium benzoat dalam sampel (Departemen Perindustrian RI, 1992).
3.5.4 Penetapan Kadar Natrium Benzoat pada Sampel 3.5.4.1 Pembuatan Larutan Baku Asam Benzoat
Asam benzoat ditimbang 50 mg, dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dilarutkan dengan dietil eter, diencerkan dengan dietil eter sampai garis tanda.
Konsentrasi larutan induk baku = 50 mg
100 ml x 1000 mcg/ml = 500 mcg/ml.
3.5.4.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Benzoat
Larutan baku asam benzoat dipipet 6 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan dietil eter sampai garis tanda, diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm. Dietil eter digunakan sebagai blanko.
3.5.4.3 Kurva Kalibrasi Asam Benzoat
Larutan baku asam benzoat dipipet 3,0; 4,5; 6,0; 7,5; 9,0 ml, dimasukkan
(konsentrasi larutan asam benzoat adalah 30; 45; 60; 75; 90 ppm). Serapan diukur pada panjang gelombang 271 nm. Dietil eter digunakan sebagai blanko.
3.5.4.4 Penetapan Kadar Natrium Benzoat pada Sampel
Larutan uji dibuat dengan menimbang 5 g sampel, dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, ditambahkan larutan natrium klorida jenuh hingga 100 ml, disaring. Filtrat diasamkan dengan 1 ml asam klorida pekat, dihomogenkan sampai sempurna, dimasukkan ke corong pisah, diekstrak dengan 15 ml dietil eter. Lapisan eter dipisahkan ke erlenmeyer sedangkan lapisan bawah diekstrak lagi dengan 10; 5; 15 ml dietil eter. Lapisan dietil eter dimasukkan ke corong pisah, dicuci dengan 15 ml asam klorida 0,1%. Lapisan bawah dibuang, lapisan atas dicuci lagi dengan 10 ml asam klorida 0,1% sebanyak dua kali. Ekstrak dietil eter dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan dietil eter hingga garis tanda lalu dihomogenkan. Ekstrak dietil eter sebanyak 25 ml diencerkan dengan dietil eter dalam labu tentukur 50 ml hingga sampai garis tanda, dihomogenkan. Serapan diukur dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 271 nm (Anonim, 2000).
Menurut Rohman (2007), kadar asam benzoat dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi:
y = ax + b
Rumus perhitungan kadar asam benzoat:
K = X x V x FpBs
Keterangan: K = Kadar asam benzoat dalam sampel (mcg/g) X = Kadar asam benzoat sesudah pengenceran V = Volume sampel (ml)
Fp = Faktor pengenceran Bs = Berat sampel (g)
Kadar natrium benzoat dapat ditentukan dari berat molekulnya (BM).
Kadar natrium benzoat = kadar asam benzoat xBM natrium benzoatBM asam benzoat