BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Tanaman yang Bersifat Antikanker
2.4.2 Pengujian sifat antikanker dari berbagai tanaman
2.4.2.2 Metode pengujian aktivitas antikanker
Pengujian aktivitas antikanker dapat dilakukan dari beberapa parameter, antara lain uji sitotoksik, indeks selektivitas, analisis isobologram, combination index
(CI), pemacuan apoptosis dan siklus sel dengan metode flow cytometry, dan pengujian ekspresi protein dengan metode imunositokimia. Uji sitotoksik dilakukan secara in vitro untuk menentukan potensi sitotoksik suatu senyawa, seperti obat antikanker. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo yang menimbulkan kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik. Respon sel terhadap obat sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel. Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Reaksi warna yang terjadi dapat dilihat pada Gambar 2.3. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium, yang termasuk dalam mitokondria dari sel hidup.
Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10% SDS dalam HCl 0,01 N. Intensitas warna ungu terbentuk dapat ditetapkan dengan spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel. Persentase viabilitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut (Kupcik, et al., 2001).
Gambar 2.3 Reduksi MTT menjadi formazan(Kupcsik, et al., 2011) absorbansi sampel
% Viabilitas = x 100 %
absorbansi kontrol
Nilai indeks selektivitas diperoleh dengan menggunakan sel yang berasal dari ginjal monyet hijau afrika (sel Vero) menggunakan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT). Indeks selektivitas diperoleh dari rasio IC50 sel Vero sel dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Nilai lebih tinggi dari 3 menunjukkan bahwa obat atau ekstrak memiliki selektivitas yang tinggi (Weerapreeyakul, et al., 2012).Indeks selektivitas dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:
IC50 sel Vero Indeks selektivitas =
Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah isobologram dan Combination Index (CI).
CI= (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 Keterangan:
Dx : konsentrasi satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk
memberikan efek sebesar efek kombinasi, yaitu IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker payudara
(D)1 dan (D)2 : besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama.
Combination Index (CI) yang diperoleh diinterpretasikan seperti pada Tabel 2.2.
Tabel 2.2 Interpretasi nilai CI (Combination Index)
Sumber: Reynolds, et al., (2005)
Pengujian siklus sel dan apoptosis menggunakan metode flow cytometry.
Flow cytometry adalah teknik yang digunakan untuk menghitung dan menganalisis partikel mikroskopis yang tersuspensi dalam aliran fluida (Sayed, et al., 2009). Prinsip dasar dari metode ini adalah berdasarkan fluoresensi. Suspensi sel atau partikel yang hendak dianalisa disedot atau dialirkan. Aliran dikelilingi oleh fluida yang sempit, sel akan melewati satu demi satu melalui sinar laser terfokus. Sinar laser akan menyerang sel tersebut. Sel yang sesuai dengan cahaya laser dan panjang gelombang yang tepat dapat dipancarkan kembali sebagai fluoresensi jika sel mengandung zat alami fluorescent satu atau lebih fluorochrome-label antibodi melekat pada permukaan atau struktur internal sel. Penyerapan cahaya tergantung
CI Interpretasi CI Interpretasi
<0,1 sinergis sangat kuat 0,1–0,3 sinergis kuat 0,3–0,7 sinergis 0,7–0,9 sinergis ringan-sedang 0,9–1,1 mendekati additif 1,1–1,45 antagonis ringan-sedang 1,45–3,3 antagonis
oleh serangkaian dioda. Filter optik berfungsi untuk memblokir cahaya yang tidak diinginkan. Hasil data disimpan melalui komputer (Ulfah, 2010). Flow cytometry
dapat digunakan untuk menganalisa DNA content sel melalui pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide (PI) atau 4’,6’-diamino-2-phenylindole (DAPI). Dengan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propidium iodide, maka tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom maka intensitas fluoresensi akan semakin besar. Untuk pengujian apoptosis, ditambahkan antibodi Annexin V dan propidium iodida, sedangkan pengujian siklus sel ditambahkan antibodi propidium iodida. Lalu diukur dengan alat
flow cytometer (Hostanska, et al., 2004). Flow cytometer atau FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel (Givan, 2001). Skema alat flow cytometer ditunjukkan oleh Gambar 2.4.
Gambar 2.4 Skemaalat flow cytometer Pewarnaan
Sel kultur
Sel yang telah disuspensikan Penambahan antibodi Laser Sel dihomogenkan Penetapan Ampas
Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen. Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen) yang akan mewarnai sel. Untuk menjamin antibodi agar dapat mengikat antigen, sel harus difiksasi dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat sehingga antigen akan immobile. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel pada slide mikroskop,
coverslip, atau bahan pendukung plastik yang sesuai. Ada dua macam metode fiksasi, yaitu pelarut organik dan reagen cross-linking. Pelarut organik seperti alkohol dan aseton akan memindahkan lipid, mendehidrasi sel, dan mengendapkan protein. Reagen cross-linking seperti paraformaldehid membentuk jembatan intermolekuler melalui gugus amino bebas. Imunositokimia melibatkan inkubasi sel dengan antibodi. Antibodi akan berikatan dengan antigen atau protein spesifik di dalam sel. Antibodi yang tidak berikatan dipisahkan dengan pencucian, sedangkan antibodi yang berikatan dideteksi secara langsung dengan antibodi primer berlabel dan secara tidak langsung dengan antibodi sekuder berlabel enzim atau fluoresen. Interpretasi data ekspresi protein tertentu akan ditunjukkan dengan warna coklat pada
sitoplasma (bukan inti sel). Warna biru pada sitoplasma menunjukkan tidak adanya ekspresi pada sel atau level ekspresi yang rendah sehingga tidak terdeteksi (Anonim, 2010). Keuntungan metode imunositokimia ini adalah hasil pemeriksaan cepat didapat (24 jam), mudah, relatif murah, dan dapat digunakan untuk pemeriksaan sampel dalam jumlah banyak (Abbas, et al., 2003; Stites, et al., 1997).
