Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dimulai dengan tahap isolasi dan seleksi bakteri kandidat probiotik yang dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB, dengan menggunakan ikan jelawat yang berasal dari Unit Pembenihan Ikan Sentral Anjongan Kalimantan Barat. Tahap isolasi dan seleksi bakteri kandidat probiotik ini dilakukan mulai bulan Desember 2008 sampai Februari 2009. Tahap selanjutnya yaitu percobaan pemeliharaan ikan jelawat yang dilakukan di Laboratorium Lapangan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB dari bulan April sampai Juni 2009.
Tahapan Penelitian
Isolasi dan Pemurnian Bakteri Kandidat Probiotik
Bakteri diisolasi dari saluran pencernaan (usus) 10 ekor ikan jelawat berukuran 15 g/ekor yang dipelihara di Laboratorium Lapangan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Usus ditimbang dan diukur panjangnya, kemudian digerus dan setiap 1 g diencerkan dengan 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%) steril. Pengenceran berseri dilakukan dari 10-2 sampai 10-10 dengan cara mengambil 0,1 ml dari tempat penggerusan dan dimasukkan pada eppendorf sebagai pengenceran pertama, selanjutnya dari eppendorf pertama diambil sebanyak 0,1 ml untuk pengenceran kedua dan seterusnya hingga pengenceran terakhir yaitu pengenceran ke sepuluh. Inokulum yang dikultur dengan metode cawan sebar pada media TSA adalah pengenceran ke sembilan dan ke sepuluh. Kultur ini kemudian diinkubasi pada suhu 29oC selama 24 jam agar bakteri tumbuh.
Isolat yang digunakan adalah isolat yang tumbuh secara terpisah. Isolat diambil dengan jarum ose yang digoreskan di media TSA pada cawan petri, kemudian diinkubasi pada suhu 29oC selama 24 jam. Dari media TSA pada cawan petri, isolat dimurnikan lagi pada media TSA di agar miring pada
tabung reaksi. Metode purifikasi dilakukan berulang-ulang dengan teknik dan media yang sama sampai didapatkan koloni bakteri tunggal dan seragam.
Seleksi Bakteri
Percobaan ini bertujuan untuk menemukan bakteri yang berpotensi tinggi untuk dipilih sebagai probiotik. Seleksi bakteri dilakukan melalui tahapan 1) pengujian aktivitas amilolitik, proteolitik, dan lipolitik; 2) fase pertumbuhan bakteri; 3) ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu; 4) uji penempelan dan 5) pengujian aktivitas antagonistik dengan bakteri patogen.
Pengujian Aktivitas Proteolitik, Lipolitik dan Amilolitik
Pengujian ini bertujuan untuk mengukur besarnya kemampuan aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik dari masing masing isolat yang diuji melalui uji hidrolisis kasein, lemak dan pati (Lampiran 1). Hidrolisis protein ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling isolat yang ditumbuhkan pada media agar dengan penambahan kasein. Hasil hidrolisis lemak ditandai dengan adanya warna kehijauan pada isolat yang ditumbuhkan pada media agar dengan penambahan lemak (minyak zaitun) dan hidrolisis pati (amilum) ditandai dengan perubahan warna zona isolat menjadi kuning cerah pada media agar dengan penambahan pati.
Penentuan Fase Pertumbuhan Bakteri
Pencapaian fase ekponensial bakteri dapat ditentukan dengan fase pertumbuhan bakteri. Persiapan kultur dilakukan dengan cara menginokulasikan 0,1 ml isolat bakteri ke dalam 10 ml media kultur cair dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29°C. Sediaan ini disebut kultur segar yang kemudian diambil 1 ml dan diinokulasikan ke dalam media kultur steril 100 ml dan diinkubasi kembali pada suhu 29°C. Pertumbuhan bakteri diamati setiap 2 jam dengan mengukur nilai kerapatan atau optical density (OD) dengan menggunakan alat spektrofotometer, dengan panjang gelombang 620 nm (Hadioetomo 1990).
13
Uji Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu
Untuk bertahan dalam lambung dan saluran pencernaan yang ber-pH rendah diuji dengan ketahanan asam lambung dan garam empedu. Metode ini mengacu pada Ngatirah et al. (2000) yaitu dengan menginokulasikan 1 ml isolat bakteri ke dalam satu seri tabung yang berisi 9 ml larutan media steril dengan pH 2,5 (diatur dengan penambahan HCL) dan pH 7,5 (diatur dengan penambahan NaOH) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 29°C. Selanjutnya sel bakteri yang tumbuh dihitung dengan metode hitungan cawan setiap 2, 4, 6 dan 8 jam. Ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu ditentukan oleh selisih jumlah koloni antara kontrol (pH 7,0) dan perlakuan (pH 2,5 dan pH 7,5). Semakin kecil selisihnya maka semakin tahan terhadap asam larnbung dan garam empedu.
Uji Penempelan
Uji ini mengacu pada metode berdasarkan Dewanti dan Wong (1993) yang menggunakan lempeng baja. Terlebih dahulu lempeng baja disterilkan dengan cara direndam dalam larutan deterjen yang dipanaskan sampai mencapai suhu 40-45°C selama 24 jam, kemudian lempeng baja dibilas dengan air panas 40-50°C sampai bersih lalu dikeringanginkan, selanjutnya diautoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit.
Pengujian dilakukan dengan cara meletakkan lempeng baja di dalam erlenmeyer 1 L dengan posisi berdiri. Erlenmeyer sebelumnya telah diisi dengan 250 ml TSB steril dan telah diinokulasi 1 ml kultur segar bakteri. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan ditempatkan dalam shaker
selama 24 jam pada suhu 29°C. Setelah 24 jam lempeng baja dibilas dengan larutan buffer fosfat (BF). Kemudian permukaan lempeng diseka secara merata dengan menggunakan swab. Swab dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml BF dan divortex selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan pengenceran serial dan dihitung populasi bakteri dengan metode hitungan cawan.
Jumlah bakteri yang tumbuh pada media dalam erlenmeyer juga dihitung dengan cara mengambil 1 ml cairan dari media tumbuh dan
diencerkan dengan 9 ml buffer fosfat. Selanjutnya dilakukan penghitungan populasi bakteri yang tumbuh dengan metode hitung cawan. Bakteri yang mampu membentuk biofilm dengan baik akan mampu menempel pada substrat yaitu usus.
Uji Aktivitas Antagonistik terhadap Bakteri Patogen
Bakteri hasil isolasi diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri Aeromonas hydrophila dengan metode Kirby-Bauer (Lay, 1994). Biakan cair bakteri kandidat probiotik dan bakteri A. hydrophila yang diinkubasi pada suhu 29OC dan berumur 24 jam diencerkan hingga memiliki konsentrasi yang sama (107 cfu/ml).
Bakteri A. hydrophila dalam media cair diambil sebanyak 0,1 ml, lalu disebarkan dengan batang penyebar pada media TSA pada cawan petri. Selanjutnya masing-masing bakteri kandidatprobiotik diambil dan dimasukkan dalam eppendorf dan kertas cakram (diameter 6 mm) direndam dalam eppendorf berisi suspensi bakteri kandidat probiotik tersebut selama beberapa saat. Kertas cakram kemudian diambil dengan menggunakan pinset steril dan ditempatkan pada cawan petri yang telah disebari bakteri A. hydrophila. Setiap cawan petri ditempatkan 3 kertas cakram yang berasal dari satu bakteri kandidat probiotik dan ditambah dengan satu kertas cakram yang telah direndam dengan larutan fisiologis sebagai kontrol. Masing-masing isolat bakteri kandidat probiotik diuji daya hambatnya dengan bakteri A. hydrophila
yang digunakan dengan tiga kali ulangan. Isolat yang menghasilkan zona bening berarti menunjukkan kemampuan menghambat bakteri A. hydrophila.
Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik pada Ikan Jelawat
Uji patogenisitas dilakukan untuk melihat apakah bakteri yang diberikan bersifat patogen atau tidak terhadap ikan jelawat. Uji ini dilakukan dengan cara menyuntikkan bakteri kandidat probiotik secara intramuskular dengan konsentrasi 107 cfu/ml. Ikan dipelihara selama 7 hari dan diamati setiap hari. Pada akhir pemeliharaan tingkat kelangsungan hidup ikan jelawat dihitung dan dibandingkan dengan kontrol yakni ikan yang disuntik dengan
15
larutan fisiologis. Kandidat probiotik yang akan digunakan adalah bakteri yang tidak bersifat patogen yakni bakteri yang tidak menyebabkan ikan jelawat sakit dan mati pada saat uji patogenisitas ini.
Pakan Percobaan pada Ikan Jelawat
Pakan yang digunakan yaitu pakan komersial (Tabel 1) dan ditambahkan kandidat probiotik. Sebelum dicampurkan ke dalam pakan dilakukan kultur cair yang ditempatkan dalam shaker dengan suhu 29°C dengan kecepatan 180 rpm dan dilakukan pemanenan sesuai waktu pencapaian fase eksponensial. Hasil kultur bakteri yang didapat dipindahkan ke dalam tabung ulir dan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Hasil endapan bakteri probiotik inilah yang dicampurkan ke dalam pakan (Lampiran 2). Probiotik sebanyak 10 g/kg (Wang 2007) ditambahkan ke dalam pakan dengan cara disemprotkan secara merata menggunakan spuit dengan menambahkan 2% kuning telur. Kemudian pakan dianalisa proksimat kembali dengan hasil seperti terlihat pada Lampiran 3.
Tabel 1 Hasil analisa proksimat pakan komersil yang digunakan
Komposisi Kandungan (%) Protein 36,96 Lemak 3,50 Serat kasar 1,37 Kadar Abu 11,67 Kadar Air 7,80
Pakan yang diberikan pada percobaan ini terdiri dari 1. Pakan komersial yang tidak ditambahkan probiotik.
2. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil protease (isolat U12).
3. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil lipase (isolat S1). 4. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil amilase (isolat
U4).
5. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil protease, lipase dan amilase (U7).
Selanjutnya pakan ini diberikan pada ikan jelawat selama percobaan pemeliharaan untuk selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan, uji daya cerna dan uji aktivitas enzim saluran pencernaan.
Uji Pertumbuhan pada Ikan Jelawat
Pemeliharaan ikan dilakukan pada wadah akuarium yang berukuran 50 x 50 x 40 cm sebanyak 15 buah. Sisi bagian luar akuarium ditutup dengan plastik hitam untuk memberikan rasa aman ikan dari gangguan luar. Sebelum digunakan, semua peralatan diberi desinfektan dengan kaporit. Akuarium diisi air yang berasal dari tandon dengan ketinggian 70%. Air dari tandon disaring terlebih dahulu dan diaerasi tinggi. Air disterilkan selama 3 hari dan pada hari ke empat ikan dimasukkan ke dalam akuarium.
Keterangan : A : Kontrol D : Amilase
B : Protease E : Gabungan (Protease, lipase dan amilase) C : Lipase
Gambar 1 Skema tata letak akuarium.
Ikan jelawat dengan bobot rata-rata 5,69 ± 0,04 g ditebar dengan kepadatan 10 ekor per wadah. Pemeliharaan ikan dilakukan selama 60 hari dan diberi pakan satiation sebanyak tiga kali sehari, yaitu pukul 07.00, 12.00 dan 17.00. Penggantian air dilakukan setiap hari sebanyak 10% dan penyiponan dilakukan setiap pagi hari untuk membersihkan sisa pakan dan feses. Jumlah pakan yang diberikan selama pemeliharaan ditimbang dan dicatat untuk menghitung konversi pakan dan Untuk mengetahui laju pertumbuhan ikan dilakukan sampling setiap 10 hari sekali. Untuk menghitung retensi protein, tubuh ikan jelawat pada akhir penelitian dianalisa proksimat. Pengukuran
1 C2 2 A2 3 B1 4 E1 5 B2 6 E2 7 D1 8 B3 9 C3 10 D3 11 A3 12 C1 13 E3 14 D2 15 A1
17
kualitas air dilakukan pada awal, tengah dan akhir pemeliharaan meliputi pH (6,94-7,42), suhu (29-310C), dissolve oksigen (DO) (4,1-5,65 mg/l) dan amoniak (0,017-0,107 mg/l). Pada uji pertumbuhan ini dianalisis beberapa parameter yaitu :
1. Laju Pertumbuhan Harian
Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan rumus yang dikemukakan oleh Huisman (1976) :
% 100 1⎥ × ⎦ ⎤ ⎢ ⎣ ⎡ − = t Wo Wt α
Keterangan: α = Laju pertumbuhan harian (%) Wt = Bobot akhir (g)
W0 = Bobot awal (g)
t = Waktu
2. Jumlah Konsumsi Pakan
Jumlah konsumsi pakan merupakan jumlah pakan yang dikonsumsi oleh ikan selama pemeliharaan. Jumlah konsumsi pakan dapat dihitung dengan cara menimbang jumlah pakan yang dikonsumsi ikan setiap harinya selama masa pemeliharaan.
3. Konversi Pakan
Konversi pakan dihitung menggunakan rumus yang dikemukakan NRC (1983) ) ) ((Wt D Wo F FCR − + =
Keterangan : FCR = Konversi pakan
F = Bobot pakan yang diberikan selama percobaan (g) Wt = Bobot ikan pada akhir penelitian (g)
Wo = Bobot ikan pada awal penelitian (g)
D = Jumlah bobot ikan yang mati selama penelitian (g) 4. Retensi Protein
Retensi protein dihitung dengan rumus yang dikemukakan oleh Takeuchi (1988):
= ×100%
Pe
Pu
RP
Keterangan : RP = Retensi protein
Pu = Bobot protein yang disimpan dalam tubuh (g) Pe = Bobot protein yang dikonsumsi oleh ikan (g)
5. Kelangsungan Hidup
Perhitungan kelangsungan hidup berdasarkan rumus (Effendi, 2002). % 100 × = No Nt SR
Keterangan : SR = Kelangsungan hidup ikan (%)
Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir penelitian (ekor)
No = Jumlah ikan yang hidup pada awal penelitian (ekor)
6. Populasi Bakteri Probiotik
Pengamatan populasi bakteri dalam saluran pencernaan ikan dilakukan pada akhir penelitian. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan kontrol secara deskriptif.
Uji Daya Cerna Pakan
Pengujian daya cerna pakan dilakukan secara terpisah dari uji pertumbuhan. Pakan yang akan digunakan dihaluskan menjadi serbuk dan ditambahkan 0,6 % Cr2O3 sebagai indikator kecernaan dan CMC sebesar 20 g/kg pakan sebagai perekat (Watanabe 1988). Selanjutnya pakan serbuk dibuat pelet lagi dan dikeringkan. Pakan diberikan pada ikan selama seminggu dan pada hari ketujuh dilakukan pengumpulan feses ikan dengan cara menyipon akuarium dengan selang kecil dan ditampung dalam ember. Selanjutnya disaring dan feses yang terkumpul ditempatkan pada botol film untuk selanjutnya dianalisa. Feses yang terkumpul dikeringkan dalam oven bersuhu 110°C selama 4-6 jam. Selanjutnya dilakukan analisa kandungan Cr2O3 terhadap feses yang sudah dikeringkan (Lampiran 4).
Nilai kecernaan dihitung berdasarkan Takeuchi (1988) : Kecernaan protein (%) = 1-(a'/a )/(b'/b) x 100 Kecernaan Total (%) = 1-(a'/a ) x 100 Keterangan :
a = % Cr2O3 dalam pakan a" = % Cr2O3 dalam feses b' = % protein dalam feses b = % protein dalam pakan
19
Uji Aktivitas Enzim Saluran Pencernaan
Uji aktivitas enzim dilakukan pada saluran pencernaan ikan di akhir penelitian. Hal ini dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya pengaruh dari penambahan probiotik pada pakan yang diberikan dibandingkan kontrol. Ikan diambil sebanyak 2 ekor dari setiap akuarium kemudian dibedah untuk diambil saluran pencernaannya. Preparasi ekstrak enzim saluran pencernaan ikan ini dilakukan pada suhu 4°C (Lampiran 5). Saluran pencernaan ikan kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas penghisap. Selanjutnya usus ditimbang dan dihomogenkan dengan menambahkan larutan buffer 10 ml. Setelah homogen lalu disentrifuse selama 20 menit pada 1200 rpm untuk mendapatkan supernatan yang akan digunakan pada pengujian selanjutnya yaitu aktivitas enzim (Lampiran 6).
Analisis Data
Penelitian ini dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari empat perlakuan dan tiga ulangan. Data yang diperoleh dianalisa dengan menggunakan analisis sidik ragam pada tingkat kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat pengaruh antar perlakuan terhadap masing-masing peubah yang diamati (Mattjik dan Sumertajaya 2000).