TINJAUAN PUSTAKA
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari 2006 sampai dengan bulan September 2006. Percobaan in vitro dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agonomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian, IPB, Bogor. Percobaan uji sitologi yaitu penghitungan jumlah kromosom dilakukan di Laboratorim Sitologi Herbarium Bogoriense LIPI, Bogor.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan
Bahan tanaman : bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah plantlet tanaman Stevia rebaudiana Bertoni M klon Zweeteners yang berumur 4 minggu yang ditumbuhkan secara in vitro pada media MS0 (Murashige dan Skoog tanpa zat pengatur tumbuh). Klon ini merupakan klon yang diintroduksi dari Belanda. Eksplan yang digunakan berupa mata tunas aksilar dari plantlet.
Media kultur jaringan : media dasar dari komposisi MS tanpa zat pengatur tumbuh untuk perbanyakan eksplan, MS+1.5 mg/l BAP+0.5 mg/l IAA untuk induksi tunas, MS+0.1 mg/l NAA untuk menginduksi perakaran. Sebagai sumber karbohidrat digunakan gula 30 g/l dan pemadat agar-agar 6 g/l dengan pH larutan media diatur menjadi 5.9.
Bahan yang digunakan untuk uji sitologi : Planlet tanaman stevia, asam asetat 45%, HCl 1 N, aquades, Orsein 2%, Hidroksikuinolin 0.002 M dan cat kuku yang tak berwarna.
Bahan-bahan lain yang diperlukan saat penanaman eksplan : alkohol 70% dan spirtus
Alat
Peralatan yang digunakan di laboratorium : timbangan, labu takar, gelas kimia, laminar air flow cabinet, pengaduk, autoklaf, pH meter, botol kultur,
magnetic stirer, panci perebus, pipet, cawan petri, gunting, pinset, scalple, stoples, hand sprayer, rak kultur, penggaris, kertas label, alat pengering dan kamera.
Peralatan yang digunakan untuk uji sitologi : mikroskop dan perlengkapannya, silet, botol bekas cat kuku, lemari es, pensil dengan ujung berpenghapus, pemanas air, pinset dan gelas kimia.
Metode Penelitian
Penelitian disusun dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal, yaitu kombinasi konsentrasi kolkisin dengan lama perendaman. Terdapat 11 perlakuan dengan masing-masing perlakuan terdiri dari tiga ulangan, pada setiap ulangan terdiri dari 10 botol kultur dengan dua eksplan per botol, sehingga jumlah total eksplan sebanyak 660 eksplan. Sebagai unit terkecil dalam penelitian ini adalah eksplan. Model statistika yang digunakan sebagai berikut:
Yij = µ + αi + εijk Keterangan :
Yij : Nilai pengamatan pada perlakuan kolkisin ke-i pada ulangan ke j
µ : Nilai tengah umum
εijk : Pengaruh galat dari satuan percobaan ke-i, pada ulangan ke-j Perlakuan :
P1 : Perendaman dengan air selama 24 jam P2 : Perendaman dengan air selama 48 jam P3 : Perendaman dengan air selama 72 jam
P4 : Perendaman dengan konsentrasi 0.02% larutan kolkisin selama 24 jam P5 : Perendaman dengan konsentrasi 0.02% larutan kolkisin selama 48 jam P6 : Perendaman dengan konsentrasi 0.02% larutan kolkisin selama 72 jam P7 : Perendaman dengan konsentrasi 0.04% larutan kolkisin selama 24 jam P8 : Perendaman dengan konsentrasi 0.04% larutan kolkisin selama 48 jam P9 : Perendaman dengan konsentrasi 0.06% larutan kolkisin selama 24 jam P10 : Perendaman dengan konsentrasi 0.06% larutan kolkisin selama 48 jam P11 : Perendaman dengan konsentrasi 0.06% larutan kolkisin selama 72 jam
Data yang diperoleh dianalisis dengan uji F pada taraf 5%. Apabila terdapat beda nyata dari nilai tengahnya dilakukan uji lanjut dengan menggunakan DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf 5%.
Pelaksanaan Penelitian
Pembuatan Media dan Sterilisasi
Pembuatan media tanam MS sebanyak satu liter adalah dengan cara memipet sejumlah larutan stok seperti tercantum dalam Tabel Lampiran 1 ke dalam gelas kimia atau botol kultur, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar. Gula pasir seberat 30 g dilarutkan dalam botol kultur dengan sedikit air kemudian dimasukkan dalam labu takar yang telah berisi larutan stok, lalu ditambahkan 1.5 ml BAP 1000 ppm dan 0.5 ml IAA 1000 ppm, selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera (satu liter) dan pH diukur dan diatur agar sesuai dengan kondisi tumbuh eksplan. Dalam penelitian ini pH yang digunakan adalah 5.9. Untuk mendapatkan pH yang diinginkan dilakukan penambahan KOH 1 N jika pH larutan dibawah 5.9 dan dilakukan penambahan HCL 1 N jika pH diatas 5.9, setelah diatur pHnya larutan ini kemudian dituang ke dalam dalam panci, selanjutnya ditambahkan agar-agar 7 g/l. Larutan media dipanaskan untuk melarutkan agar – agar sambil diaduk sampai mendidih, kemudian dituangkan ke dalam botol kultur sebanyak 25 ml/botol (volume botol 200 ml). Selanjutnya botol ditutup plastik dan diikat dengan karet gelang. Media disterilisasi menggunakan autoklaf dengan tekanan 17.5 ψ, 1210
C selama 20 menit.
Sterilisasi alat seperti pisau, pinset, scalpel, cawan petri, botol kultur kosong, dan botol berisi air steril disterilisasi menggunakan autoklaf dilakukan selama satu jam pada suhu 121o C dan tekanan 17.5 ψ.
Sub Kultur Planlet
Planlet yang sudah steril disub kultur ke dalam media MS0. Tunas dipotong–potong pada masing–masing buku dengan ukuran ± 5 mm kemudian ditanam didalam media MS0. Pada saat penanaman, semua peralatan yang
digunakan disemprot alkohol 70%, sebelum dimasukan ke dalam laminar air flow cabinet
Alat–alat yang digunakan untuk memindahkan eksplan, sebelum digunakan dibakar dahulu sampai panas kemudian didiamkan dulu sampai dingin. Pada setiap botol ditanam 5 eksplan. Inkubasi kultur dilakukan pada ruangan dengan penyinaran ± 650 lux, 16 jam/hari dan suhu ± 23o
C. Setelah 4 MST planlet yang dihasilkan dijadikan sumber propagul.
Pembuatan Larutan Kolkisin
Sebelum dibuat larutan dengan konsentrasi 0.02, 0.04 dan 0.06%, terlebih dahulu dibuat larutan stok dengan konsentrasi 2% (1 g/50ml aquabides steril). Pembuatan larutan kolkisin dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Pada saat kolkisin dibuka blower dimatikan sejenak, lalu kolkisin dimasukan ke dalam aquabidest steril. Setelah botol berisi kolkisin ditutup blower dinyalakan kembali, kemudian larutan dikocok hingga larut. Larutan disterilkan dengan menggunakan microfilter. Pada waktu membuat larutan stok kolkisin digunakan juga alat pengaman seperti sarung tangan karet dan masker khusus dengan filter udara. Larutan kolkisin yang sudah jadi ditempatkan dalam labu erlenmeyer tertutup dan disimpan pada suhu 4 ˚C
Pembuatan larutan perlakuan dilakukan dengan menggunakan teknik pengenceran. Pembuatan 100 ml larutan konsentrasi 0.02% dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 1 ml, kemudian dimasukan ke dalam botol yang berisi 99 ml aquades steril. Larutan tadi dikocok hingga larut sempurna. Pembuatan 100 ml larutan konsentrasi 0.04% dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 2 ml, kemudian dimasukan ke dalam botol yang berisi 98 ml aquades steril. Larutan kolkisin 0.06 % dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 3 ml, kemudian dimasukan ke dalam botol yang berisi 97 ml aquades steril. Sebagai kontrol digunakan air steril.
Perendaman dengan Larutan Kolkisin dan Penanaman Eksplan
Planlet yang telah disubkultur selama 4 MST dipotong–potong dengan 1 buku tunas dengan ukuran ± 5 mm, bagian buku yang mengandung mata tunas 14
aksilar dipisahkan dan dimasukan ke dalam larutan kolkisin dengan konsentrasi masing-masing 0.0, 0.02, 0.04 dan 0.06 %, kemudian setelah 24 jam sebagian eksplan diambil dan ditanam di dalam media pertunasan yaitu MS yang ditambah ZPT (zat pengatur tumbuh) IAA dan BAP dengan konsentrasi masing-masing 0.5 mg/l dan 1.5 mg/l. Penanaman ke media pertunasan ini diulang 24 jam berikutnya sampai 72 jam setelah perendaman. Alat–alat yang digunakan untuk memindahkan eksplan, sebelum digunakan di bakar dahulu sampai panas kemudian didiamkan dulu sampai dingin. Pada setiap botol ditanam dua eksplan. Inkubasi kultur dilakukan pada ruangan dengan penyinaran ± 650 lux, 16 jam/hari dan suhu ± 23o
C.
Pemindahan ke Media Perakaran
Pada proses pengakaran, tunas berumur 11 MST diambil pucuknya, berukuran panjang ± 3 cm. Tunas ditanam di dalam media pengakaran yaitu MS yang ditambah 0.1 mg/l NAA. Pada setiap botol ditanam lima pucuk.
Uji Sitologi
Penghitungan jumlah kromosom menggunakan metode squashing. Bahan yang diambil adalah ujung akar dan pucuk planlet yang sudah berumur 4 MST di dalam media perakaran. Ukuran tanaman yang diambil ± 1 cm dari ujung akar dan pucuk. Pengambilan preparat dilakukan selama 22 jam dari pukul 04.00-13.00 WIB pada hari pertama dan dari pukul 14.00-01.00 WIB pada hari berikutnya, dengan selang waktu pengambilan preparat setiap satu jam sekali, untuk mendapatkan tahap mitosis yang tepat. Setelah Mengetahui waktu yang tepat waktu yang tepat, analisis sampel yang lain dilakukan pada jam yang sama ketika metafase terdeteksi. Semua perlakuan dilakukan uji sitologi dengan sampel yang diambil secara acak. Perlakuan kolkisin 0.04% selama 72 jam tetap disertakan dalam uji sitologi.
Pengambilan material : ujung akar dipotong sepanjang ± 1 cm kemudian dimasukkan ke dalam air untuk menghilangkan kotorannya. Potongan bahan tanaman tersebut kemudian dimasukan ke dalam botol berisi hidroksiquinolin
0.002 M (0.32 g/l aquades). Selanjutnya botol tersebut disimpan pada suhu 20oC selama 3–5 jam.
Fiksasi : potongan ujung akar dimasukkan ke dalam air bersih kemudian dibuang tudung akarnya dengan pisau silet, potongan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam larutan asam asetat 45% selama 10 menit. Selanjutnya potongan diangkat dan dimasukan ke dalam larutan yang terdiri dari 1 N HCl dan asam asetat 45% dengan perbandingan 3:1 (v/v) pada suhu 80oC selama 3–5 menit. Potongan bahan tanaman tadi diangkat dan dimasukkan ke dalam pewarna Orsein 2%, selanjutnya dipindahkan pada gelas preparat yang ditetesi Orsein 2%. Potongan ujung akar tersebut dipotong lagi sehingga berukuran 1–2 mm dari ujung akar dan sisanya dibuang. Gelas penutup kemudian dipasang, dipukul– pukul perlahan–lahan dengan pangkal pensil berkaret dan dipanaskan sebentar. Selanjutnya gelas penutup ditekan halus dengan jempol dan pinggirnya direkat dengan cat kuku tak berwarna dan siap diamati di bawah mikroskop. Setelah terlihat penyebaran kromosom dilakukan penghitungan jumlah kromosom dan dibuat dokumentasinya.
Foto yang dihasilkan diperbesar dengan menggunakan Adobe Photo Shop versi 7.0 dan kembali dihitung jumlah kromosomnya. Sampel yang diamati jumlah kromosomnya adalah sebanyak 6 sampel per perlakuan.
Pengamatan
Pengamatan di laboratorium dilakukan setiap minggu selama 9 MST. Peubah yang diamati yaitu jumlah eksplan terkontaminasi, jumlah tunas, jumlah daun, persentase eksplan hidup, persentase tunas berakar dan jumlah kromosom.