3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari hingga Maret 2009, bertempat di laboratorium Kesehatan Ikan, Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi, Jawa Barat dan Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah akuarium (40x40x60)cm, alat suntik
(syringe), gelas objek, gelas penutup, eppendorf, hemometer, pipet sahli, tabung
hematokrit sentrifuse, penggaris, haemacytometer tipe Neubauer, mikroskop, kertas tisu.
Bahan yang digunakan adalah ikan mas strain wildan yang berasal dari daerah Cianjur, minyak cengkeh, darah ikan, antikoagulan (Na-sitrat 3,8%), larutan HCl 0.1 N, akuades, crytoseal, larutan Hayem’s, larutan Turk’s, bakteri
Staphylococcus aureus, PBS, larutan methanol, pewarna Giemsa.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Persiapan Wadah
Wadah yang digunakan adalah akuarium (40x40x60) cm. Akuarium yang digunakan terlebuh dahulu dibersihkan kemudian dikeringkan. Setelah itu disemprot klorin dan dibiarkan kering udara. Akuarium diisi air setinggi 30 cm dan diberi aerasi.
3.3.2 Persiapan Ikan Uji
Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas strain wildan dari daerah Cianjur. Selama beberapa hari ikan diadaptasikan terlebih dahulu sebelum perlakuan. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 60 ekor per perlakuan. Kemudian jumlah ikan dibagi 2 (masing-masing 30 ekor) pada pengamatan status kelangsungan hidup ikan dan haematologi. Selama masa adaptasi maupun perlakuan ikan diberi pakan berupa pelet sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore.
19
3.3.3 Penyuntikan Vaksin DNA
Penyuntikan dilakukan secara intramuskular, dengan tiga tingkatan dosis yaitu 2.5 µg/100µl, 7.5 µg/100µl dan 12.5 µg/100µl. Adapun kelompok perlakuannya yaitu :
Perlakuan A : Ikan disuntik dengan vaksin DNA dosis 2,5 µg/100µl Perlakuan B : Ikan disuntik dengan vaksin DNA dosis 7,5 µg/100µl Perlakuan C : Ikan disuntik dengan vaksin DNA dosis 12,5 µg/100µl Kontrol (K) : Ikan kontrol positif
Setelah vaksinasi, ikan dipelihara selama 42 hari (6 minggu).
3.3.4 Penyediaan suspensi KHV
Sebanyak satu gram insang yang terinfeksi KHV digerus kemudian disuspensikan dengan 9 ml larutan PBS. Lalu disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit dengan suhu 5 oC. Supernatan yang dihasilkan diambil dan disaring dengan kertas milipore 0.45 µm sehingga didapat konsentrasi virus dengan konsentrasi 20%, kemudian dilakukan pengenceran sampai 10-3.
3.3.5 Uji Tantang
Ikan yang telah divaksin dan telah dipelihara selama 6 minggu (42 hari) kemudian diuji tantang untuk melihat respon kekebalannya. Uji tantang dilakukan dengan menginjeksi virus aktif dengan konsentrasi pengenceran 10-3, sebanyak 0,1 ml secara intramuskular ke semua ikan uji.
3.4 Metode Pengukuran Hematologi 3.4.1 Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan setiap seminggu sekali selama pemeliharaan setelah vaksinasi dan uji tantang. Sebelum pengambilan darah, ikan terlebih dahulu dibius dengan minyak cengkeh dosis 0.04 ppt. Pada pengambilan darah, ikandiletakkan dengan kepala disebelah kiri, sebelumnya alat suntik sudah dibilas dengan Na-sitrat sedikit, kemudian darah diambil pada bagian vena caudalis yaitu pembuluh darah yang terletak tepat dibagian ventral tulang vertebrae (tulang punggung). Jarum ditusukan di antara anus dan sirip anal. Lalu jarum ditarik sedikit kemudian darah dihisap sampai batas yang diinginkan. Setelah itu alat suntik dicabut kemudian darah ditempatkan ke dalam eppendorf.
3.4.2 Perhitungan Kadar Hemoglobin
Pengukuran kadar Hemoglobin (Hb) dilakukan dengan metode Sahli yang mengkonversi darah ke dalam bentuk asam hematin setelah darah ditambah dengan asam klorida. Pertama darah dihidap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm3 atau pada skala 0.02 ml, kemudian darah dipindahkan ke dalam tabung Hb- meter yang telah diisi HCl 0.1 N sampai skala 10, aduk dan dibiarkan selama 3 – 5 menit.
Setelah itu aquades ditambahkan sampai warna darah dan HCl tersebut seperti warna larutan standar yang ada dalam Hb meter tersebut. Skala dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung sahli yang dilihat pada skala jalur gr % (kuning) yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah.
3.4.3 Perhitungan Kadar Hematokrit (Chinabut et al. 1991)
Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai mencapai ¾ bagian tabung. Kemudian ujung tabung ditutup dengan crytoseal sedalam kira-kira 1 mm, sehingga terbentuk sumbat crytoseal. Lalu tabung mikrohematokrit disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang bervolume sama berhadapan agar putaran sentrifuse seimbang. Nilai kadar hematokrit ditentukan dengan persentase panjang bagian darah yang mengendap (a) serta panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung (b) : (a/b) x 100%. Kadar hematokrit ini mencerminkan banyaknya sel darah (digambarkan dengan endapan/padatan) dalam cairan darah.
3.4.4 Penghitungan Total Eritrosit (Svobodova & Vyukusova 1991)
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 0,5). Lalu tambahkan larutan Hayem’s (berfungsi untuk mematikan sel-sel darah putih) sampai skala 101, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka delapan selama 3 – 5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada haemacytometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah merah dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah
21
eritrosit total dihitung pada 5 kotak kecil haemacytometer dan jumlahnya di hitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu 1989) :
Jumlah eritrosit : (A/N) x (1/V) x Fp Keterangan :
A = ∑ sel terhitung
V = volume kotak haemacytometer
N = ∑ kotak haemacytometer yang diamati Fp = Faktor pengenceran
3.4.5 Penghitungan Total Leukosit (Svobodova & Vyukusova 1991)
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna putih sampai skala 0,5. Lalu tambahkan larutan Turk’s (berfungsi untuk mematikan sel-sel darah merah) sampai skala 11, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka delapan selama 3 – 5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada haemacytometer tipe
Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah putih dengan
bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah leukosit total dihitung sebanyak 5 kotak besar dan dan jumlahnya dihitung dengan rumus :
Total Leukosit = jumlah sel terhitung x 50 sel/mm3
3.4.6 Pembuatan Preparat Ulas Darah (Svobodova & Vyukusova 1991)
Sebelumnya gelas objek yang akan digunakan direndam dalam methanol untuk menghilangkan lemak yang menempel. Pembuatan preparat ulas darah dilakukan dengan menempatkan setetes darah pada gelas objek, gelas objek kedua diletakan dengan suduk 45o terhadap gelas objek pertama, kemudian digeser ke belakang sehingga menyentuh darah, kemudian gelas objek kedua digeser berlawanan arah sehingga membentuk lapisan tipis darah. Selanjutnya preparat dikering-udarakan kemudian difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Kemudian preparat dibilas dengan akuades dan dikering udarakan kembali sebelum diwarnai dengan pewarna Giemsa selama 15 menit. Lalu preparat dicuci kembali dengan akuades untuk mengurangi kelebihan warna dan dikeringkan dengan tisu. Setelah itu diamati di bawah mikroskop. Persentase sel-sel leukosit dihitung dengan cara mengamati sebanyak 10 lapang pandang dan masing-masing jenis leukosit yang terhitung dikelompokan dan dipersentasi menurut jenisnya, satuannya adalah persen (%).
3.4.7 Indeks Fagositik
Sebanyak 50 µ l darah dimasukan ke dalam mikrotiter plate, ditambahkan 50 µ l suspensi Staphylococcus aureus dalam PBS (108 sel/ml), dihomogenkan dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Setelah itu sebanyak 5 µ l dibuat sediaan ulas darah dan dikering-udarakan. Lalu difiksasi dengan metanol selama 5 menit dan dikeringkan. Kemudian direndam dalam pewarna Giemsa selama 15 menit. Lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tisu. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. Jumlah sel yang menunjukan proses fagostosis dihitung dari 100 sel fagosit yang teramati.
3.5 Analisa Data
Data yang telah diperoleh dianalisis menggunakan SPSS ver 15.0 untuk uji Analisis Ragam (ANOVA) dengan uji F pada selang kepercayaan 95%, untuk menentukan apakah perlakuan berpengaruh nyata terhadap gambaran darah ikan. Apabila berpengaruh nyata, untuk melihat perbedaan antar perlakuan akan diuji lanjut dengan uji lanjutan Duncan. Garis regresi dibuat hanya pada perlakuan yang berbeda nyata dan memiliki nilai korelasi yang tinggi (>0.3) untuk mengetahui hubungan antara dosis dengan parameter hematologi.
23
