3.1 Alat dan Bahan
Bahan utama yang dipergunakan dalam penelitian ini, yaitu kitosan serpihan siap pakai dengan derajat deasetilasi 88,5% diperoleh dari Departemen Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor (spesifikasi kitosan yang digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1) dan Polivinil Alkohol (PVA) yang diperoleh dari toko Kemika Jaya. Bahan penunjang lainnya adalah asam asetat glasial 1%, plasticizer gliserin, akuades, bit, dan alkohol 70%. Sementara peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah oven atau inkubator dengan suhu 50ºC, hot plate dan magnetic stirrer, batang pengaduk, sudip, termometer, gelas piala, gelas ukur, plat kaca ukuran 20× 20 × 1 cm, neraca analitik, pipet tetes, kuas, kain saring, jar, cawan petri, styrofoam, alumminium foil, mikrometer sekrup, dan Chromameter.
3.2 Metode
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu tahap pendahuluan dan tahap penelitian utama. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mendapatkan formulasi penambahan indikator warna pada film, prosedur pengeringan dan pewarnaan film yang tepat, serta selang waktu perubahan warna film indikator. Pada tahap penelitian utama dilakukan analisis respon film indikator selama penyimpanan. Sementara untuk pembuatan film dilakukan berdasarkan hasil penelitian Putri (2012) dan Hasnedi (2009).
Selain itu, pemilihan pewarna bit sebagai indikator didasarkan pada hasil penelitian Putri (2012). Dalam penelitiannya, Putri menggunakan pewarna bit dan rosella. Pewarna dari rosella ketika dicampurkan dengan larutan film memberikan respon perubahan warna yang begitu cepat. Pada awalnya larutan campuran berwarna merah darah, namun dalam hitungan menit warna berubah menjadi merah kecoklatan, kemudian menjadi coklat secara konsisten. Oleh karena itu, pewarna rosella tidak dijadikan sebagai pewarna indikator dan pewarna bit yang digunakan sebagai indikator.
3.3.1 Penelitian Pendahuluan
3.3.1.1Ekstraksi Warna dari Bit (Putri 2012)
Bahan pewarna yang digunakan berasal dari bit. Bit yang sudah dikupas dihancurkan dengan menggunakan blender dengan diberi tambahan air. Perbandingan antara bit dan air agar larutan pewarna yang dihasilkan pekat adalah 2:1 (b/v). Setelah dihancurkan, bubur bit disaring dengan kain saring untuk mendapatkan larutan pewarna. Larutan pewarna yang didapat dicampurkan ke dalam larutan film untuk memperoleh warna yang paling baik untuk dijadikan indikator.
3.3.1.2Pembuatan Film Indikator dari Kitosan (Putri 2012)
Larutan film berbahan kitosan berdasarkan pada penelitian Putri (2012), yaitu 3.5 gram kitosan dilarutkan dalam 70 ml asam asetat glasial 1%. Pencampuran antara kitosan dengan pelarut dilakukan sedikit demi sedikit agar kitosan dapat larut dengan sempurna. Lalu larutan dihomogenkan dengan pengaduk stirer dan dipanaskan pada suhu konstan yaitu 40oC ± 60 menit hingga larutan film tersuspensi dengan sempurna. Setelah larutan tersuspensi sempurna, larutan film tersebut ditera
film yang dibuat. Larutan film kemudian dituangkan pada media plat kaca berukuran 20 × 20 cm untuk dibuat menjadi lembaran film. Agar dihasilkan ketebalan film yang merata, larutan diratakan dengan menggunakan sudip kaca. Setelah itu dilakukan pemanasan di dalam oven dengan suhu 50oC selama 24 jam. Urutan proses pembuatan larutan film berbahan dasar kitosan dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Diagram alir pembuatan film kitosan (Putri 2012). 3.3.1.3Pembuatan Film Indikator dari Kitosan-PVA (Hasnedi 2009)
Pembuatan larutan film campuran kitosan dan PVA (Polivinil Alkohol) dilakukan berdasarkan penelitian Hasnedi (2009). Pada penelitian tersebut menggunakan bahan-bahan kitosan-asetat 1 % (b/v) sebanyak 48 ml, polivinil alkohol (PVA) 1 % (b/v) sebanyak 48 ml, dan pewarna indikator pH Bromthymol Blue (BTB) 0,2% (b/v) sebanyak 4 ml. Modifikasi yang dilakukan meliputi kitosan-asetat 3% (b/v), polivinil alkohol (PVA) 3 % (b/v), dan Bromthymol Blue disubstitusi oleh pewarna bit. Perbandingan antara larutan kitosan dengan larutan PVA dalam proses pencampuran kedua larutan adalah 4:6. Diagram alir pembuatan film campuran Kitosan-PVA dapat dilihat pada Gambar 9.
Kitosan (g) Pelarutan Homogenisasi Asam asetat 1% (mL) Pemanasan 40ºC (60 menit) Pendinginan Gliserol (mL) Larutan film
Penuangan di plat kaca
Pengeringan 50oC selama 24 jam
Pelepasan film dari cetakan
Filmkitosan
akuades (mL)
Plat kaca dibersihkan dengan alkohol 70% Pewarna bit (mL)
Keterangan : *) proses yang dimodifikasi dari Hasnedi (2009) PVA (g)* akuades (mL) suhu 80ºC Kitosan (g)* Pelarutan Homogenisasi (30 menit) Asam asetat 1% (mL) Pelarutan Homogenisasi Pemanasan 40ºC (60 menit) akuades (mL) Pencampuran
Larutan PVA Larutan kitosan
Homogenisasi Gliserol (mL)
Pendinginan Larutan film
Penuangan di plat kaca
Pengeringan 50oC selama 24 jam
Pelepasan film dari cetakan
Film
Plat kaca dibersihkan dengan alkohol 70% Pewarna bit (mL)*
Dalam pembuatan lembaran film ini dilakukan sebanyak tiga tahap yaitu, pembuatan larutan PVA, pembuatan larutan kitosan, dan pencampuran kedua larutan. Mula-mula 3 gram PVA sedikit demi sedikit dilarutkan dalam akuades 80ºC, lalu dihomogenkan dengan pengaduk stirer hingga terlarut sempurna. Kemudian untuk membuat larutan kitosan cara yang dilakukan sama seperti Gambar 5, yang berbeda hanya pada komposisi bahan. Jika pada penelitian Putri 2012 kitosan yang digunakan seberat 3.5 gram yang dilarutkan dalam 70 ml asam asetat glasial 1%, maka dalam prosedur ini digunakan kitosan seberat 3 gram yang dilarutkan dalam 50 ml asam asetat glasial 1%. Tahapan selanjutnya adalah menggabungkan kedua larutan tersebut. Perbandingan yang digunakan untuk mencampur kedua larutan tersebut adalah 6:4 (v/v) (larutan PVA:larutan kitosan).
3.3.1.4Teknik Pengeringan Film Indikator
Pada tahap uji coba pengeringan larutan film ini dilakukan beberapa teknik untuk mengetahui cara pengeringan terbaik agar warna film yang dihasilkan tidak berubah warna selama pengeringan. Berdasarkan hasil penelitian Putri (2012) pewarna alami sebagai indikator warna, sangat mudah berubah warna ketika dipanaskan. Beberapa cara pengeringan pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan freeze drying, oven vaccum, dan oven blower. Tahapan yang dilakukan pada ketiga pengeringan tersebut adalah sebagai berikut:
(i). Oven blower
Larutan film yang telah dituangkan ke plat kaca, diratakan terlebih dahulu dengan menggunakan sudip kaca. Kemudian dimasukkan ke dalam oven blower yang sebelumnya telah dipanaskan hingga suhu 50ºC. Pengeringan dilakukan selama 24 jam.
(ii). Oven vacuum
Oven terlebih dahulu dinyalakan hingga mencapai suhu 50ºC. Larutan film yang telah dituangkan ke plat kaca dimasukkan ke dalam oven. Setelah itu, vacuum mulai dinyalakan. Pada pengeringan dengan oven vacuum ini dilakukan selama 3 jam.
(iii). Freeze drying
Larutan film yang telah dituangkan ke plat kaca, dibekukan terlebih dahulu pada suhu freezer(± -5ºC) selama 24 jam. Setelah 24 jam, film yang telah membeku, dimasukkan ke mesin freeze drying dan dikeringkan selama 6 jam.
3.3.1.5Pewarnaan Film dengan Metode Oles
Larutan film terlebih dahulu dikeringkan dalam oven selama 24 jam pada suhu 50ºC. Setelah itu, pewarna indikator dengan volume 6 ml/400 cm2 dioleskan pada lembaran film. Film yang telah diolesi pewarna kemudian dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama ± 1 jam. Hal tersebut dilakukan agar warna dapat menempel dengan sempurna pada lembaran film.
3.3.1.6PengamatanPerubahan Film Indikator Selama Penyimpanan
Analisis perubahan warna indikator ini dilakukan untuk mengetahui perubahan warna pada lembaran film. Film yang sudah dipotong-potong (3×3 cm) disimpan dalam lima tempat berbeda, yaitu suhu ruang (± 27ºC), suhu kulkas (3-5ºC), suhu freezer (-5-(-10)ºC), ruang gelap, dan terpapar sinar matahari. Perubahan warna diamati secara visual setiap satu jam sekali selama 24 jam. Data yang dihasilkan akan digunakan untuk menentukan titik pengamatan pada penelitian utama.
3.3.2 Penelitian Utama
3.3.2.1Pengukuran Respon Film Indikator Selama Penyimpanan
Pada tahap ini dilakukan pengamatan respon lembaran film terhadap perlakuan-perlakuan terbaik yang didapatkan pada penelitian pendahuluan. Perlakuan-perlakuan tersebut diantaranya penyimpanan lembaran film yang telah dipotong 3×3 cm pada suhu kulkas (3-5ºC), suhu freezer (-5-(-10)ºC), dan paparan matahari. Respon yang diamati adalah perubahan warna film indikator, susut bobot, dan ketebalan (prosedur analisis dapat dilihat pada Lampiran 2). Sesuai dengan hasil pengamatan (3.3.1.6), setiap suhu penyimpanan dilakukan 7 titik pengamatan untuk memperoleh garis kecenderungan perubahan film indikator selama penyimpanan.
3.3 Pengolahan Data
Data penelitian yang telah didapatkan dari penelitian utama kemudian dianalisis secara statistik. Analisis statistik dilakukan untuk mengetahui hubungan hasil pengukuran warna menggunakan Chromameter dengan lama penyimpanan, pengukuran ketebalan dengan mikrometer sekrup, dan pengukuran susut bobot. Analisis yang digunakan adalah analisis korelasi regresi linier yang dinyatakan dengan persamaan regresi. Secara matematik persamaan linier dinyatakan sebagai berikut (Usman dan Akbar 2008):
Dimana : x = lama penyimpanan
y = hasil pengukuran komponen warna/ketebalan/susut bobot a = slope garis regresi
b = nilai komponen warna/ketebalan/susut bobot pada kondisi garis regresi berpotongan dengan sumbu y
Tingkat ketepatan dan ketelitian pengukuran ditunjukkan dengan melihat nilai korelasi garis regresi (kecenderungan data). Nilai pengukuran dinyatakan baik jika nilai korelasinya lebih dari 80% (R2≥ 0.80). Menurut Usman dan Akbar (2008), nilai R2 terbesar adalah +1 dan terkecil adalah -1 sehingga dapat ditulis -1 ≤ R2≤ +1. Apabila nilai r2 = +1, maka disebut hubungan positif sempurna dan hubungannya linier langsung sangat tinggi. Sebaliknya jika nilai R2 = -1, maka disebut hubungan negatif sempurna dan hubungannya tidak langsung sangat tinggi (invers). Nilai R2 tidak mempunyai satuan (dimensi). Makna dari nilai R2 yang dihitung dapat diinterpretasikan dengan Tabel 7.
Tabel 7. Interpretasi dari nilai R2 (Usman dan Akbar 2008).
R2 Interpretasi 0 Tidak berkorelasi 0.01 – 0.20 Sangat rendah 0.21 – 0.40 Rendah 0.41 – 0.60 Agak rendah 0.61 – 0.80 Cukup tinggi 0.81 – 0.99 Tinggi 1 Sangat tinggi