3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai Oktober 2013 dilaboratorium Kimia Organik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau, Pekanbaru dan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Penelitian, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini ialah: alat-alat sterilisasi,autoklaf, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas beaker, gelas ukur, gelas erlenmeyer, pipet serologi, jarum ose, karet penghisap, spatula, hockey stick, jarum ose, mikroskop, jangka sorong, rotary evaporator, magnetic stirer dan sentrifuse.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Media Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), Mueller Hinton Agar (MHA), akuades, alkohol 70%, metanol, n-heksana, etil asetat, aluminium foil, Nistatin 10 μg , cakram kertas kosong, air laut buatan dengan kadar garam 3,5%, telur Artemia Salina Leach dan cakram kloramfenikol 30 μg (Oxoid), dimetilsulfoksida (DMSO) standar McFarland.
Mikroba patogen uji yang terdiri dari empat isolat mikroba patogen yaitu Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Salmonella thypii
merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Universitas Sumatera Utara.
3.3 Preparasi Ekstrak Biji Alpukat (Persea Americana Mill.)
Sampel yang diteliti adalah biji alpukat (Persea Americana Mill.) yang tua dan segar, diambil dari pasar tradisional di Medan. Pengambilan sampel dilakukan tanpa membandingkan dengan daerah lain. Biji diambil dicuci dan dibersihkan dari kotoran lalu dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 30-40oC sampai kering. Setelah kering sampel dihaluskan dengan belender hingga diperoleh serbuk kering atau yang disebut simplisia. Simplisia biji alpukat (Persea Americana Mill.) dimaserasi dengan merendamnya di dalam pelarut metanol selama 5 hari. Maserat yang diperoleh kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh dipisahkan dengan rotavapor sehingga terpisah pelarut dan ekstrak kental tumbuhan selanjutnya dilakukan pengenceran sehingga diperoleh ekstrak sampel dengan konsentrasi 5, 10, 15 dan 20%. Hal yang sama dilakukan untuk ekstraksi menggunakan n-heksana dan etil asetat.
3.4 Skrining Fitokimia
Uji pendahuluan kandungan metabolit sekunder dilakukan terhadap setiap ekstrak biji alpukat. Pada ekstrak ini ditambahkan masing-masing 5 ml air suling dan kloroform lalu dikocok kuat dan dibiarkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan air digunakan untuk uji senyawa flavonoid, fenolik, dan saponin. Lapisan kloroform digunakan untuk uji senyawa terpenoid, dan steroid. Sedangkan untuk uji alkaloid memiliki prosedur tersendiri.
3.4.1 Pemeriksaan Alkaloida
Pemeriksaan alkaloida, digunakan metode Culvenor-Fizgerald. Setiap ekstrak ditambahkan 10 ml larutan kloroform beramoniak 0,05 M, diaduk kemudian disaring. 1 ml asam sulfat 2 N ditambahkan ke dalam tabung reaksi, kocok selama 2 menit, biarkan hingga terbentuk dua lapisan dan terjadi pemisahan. Diambil lapisan asam (bagian atas) dan ditambahkan 1–2 tetes pereaksi Mayer atau pereaksi Dragendorff, jika terbentuk endapan putih dengan pereaksi Mayer atau warna jingga dengan pereaksi Dragendorff menunjukkan hasil yang positif untuk alkaloid.
3.4.2 Pemeriksaan Flavonoida
Beberapa tetes lapisan air pada plat tetes ditambah 1-2 butir logam magnesium dan beberapa tetes asam klorida pekat. Terjadinya warna jingga, merah muda sampai merah menandakan adanya senyawa flavonoid.
3.4.3 Pemeriksaan Fenolat
Beberapa tetes lapisan air pada plat tetes ditambah 1–2 tetes larutan besi (III) klorida 1%. Bila terbentuk warna biru/ungu, berarti terdapat senyawa fenolik.
3.4.4 Pemeriksaan Saponin
Lapisan air dalam tabung reaksi dikocok. Apabila terbentuk busa yang bertahan selama 5 menit, berarti positif adanya saponin
3.4.5 Pemeriksaan Steroida/triterpenoida
Lapisan kloroform disaring melalui pipet yang berisi norit. Hasil saringan diambil 2–3 tetes dan dibiarkan mengering pada plat tetes. Setelah kering ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat). Terbentuknya warna merah berarti positif adanya terpenoid dan warna hijau-biru berarti positif adanya steroid.
3.5 Uji Daya Hambat Ekstrak Berbagai Pelarut Terhadap Mikroba Patogen dengan Metode Kirby-Bauer
Biakan bakteri disubkultur dalam media NA dan diinkubasi pada 370C selama ± 2 hari. Hasil subkultur biakan bakteri diambil dengan jarum ose dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml akuades steril. Setelah itu dihomogenkan dengan cara divorteks dan disamakan kekeruhannya dengan standart Mac Farland sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel ≈ 108 CFU/ml.
Dalam pengujian ekstrak sampel digunakan kertas cakram kosong (Oxoid, Inggris) dengan diameter cakram 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril. Larutan ekstrak yang telah diencerkan dengan konsentrasi 5, 10, 15 dan 20% masing-masing dipipet sebanyak 10 μl selanjutnya diteteskan pada permukaan cakram dan ditunggu selama beberapa menit hingga larutan ekstrak berdifusi ke dalam cakram. Sebanyak 10 ml media Mueller Hinton Agar untuk menumbuhkan bakteri dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat. Dengan menggunakan cotton bud steril pada suspensi biakan, diusapkan perlahan-lahan pada permukaan media secara merata, selanjutnya dibiarkan mengering pada suhu kamar selama beberapa menit. Dengan menggunakan pinset steril, cakram yang telah ditetesi ekstrak dengan konsentrasi yang berbeda diletakkan secara teratur pada permukaan media uji. Kultur diinkubasi pada suhu tertentu.
Pengamatan dilakukan terhadap pengukuran zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram kertas yang menunjukkan adanya aktivitas antimikroba. Pengujian dilakukan terhadap semua mikroba uji. Pengujian yang dilakukan menggunakan pelarut metanol, etil asetat dan n-heksana. Kontrol (-) mengunakan DMSO dan kontrol (+) untuk bakteri digunakan cakram kertas kloramfenikol. Untuk pengujian antimikroba terhadap Candida albicans digunakan larutan nistatin. Candida albicans sudah ditanam terlebih dulu pada media PDA dan diinkubasi pada suhu 300C .
3.6 Uji Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test
Air laut disiapkan sintetik dengan melarutkan 38 g garam laut buatan dalam 1 L air suling. Bejana penetas disekat sehingga memiliki dua sisi ruang, yaitu sisi terbuka dan tertutup. Telur udang laut A. salina Leach ditaburkan dalam bejana penetas yang berisi air laut sintetik dan disimpan dibawah lampu dengan sisi terbuka menghadap lampu. Setelah 24 jam, telur yang sudah menetas menjadi nauplii dipindahkan ke tempat lain, 24 jam setelah itu nauplii tersebut sudah dapat digunakan sebagai hewan uji.
Dua belas vial untuk uji toksisitas masing-masing tiga konsentrasi dilakukan triplo, dengan tingkatan potensi toksisitas rendah (1000,100,10) dan tiga vial untuk kontrol. Tiga vial Larutan kontrol. Larutan stok dibuat, kemudian dimasukkan ke dalam vial yang telah disiapkan untuk masing-masing konsentrasi tersebut, larutan kemudian diuapkan dengan sempurna. Setiap konsentrasi dibuat dalam tiga vial, ke dalam masing- masing vial dimasukkan air laut sintetik kira-kira 3 ml dan 10 ekor A. salina, selanjutnya ditambahkan air laut sintetik sampai diperoleh 5 ml. Vial tersebut diletakkan di bawah lampu, setelah 24 jam dihitung jumlah larva yang mati.
BAB 4